轉(zhuǎn)基因克隆兔的初步研究.pdf

1、為建立一套兔轉(zhuǎn)基因克隆的技術(shù)體系,本研究對(duì)核移植重構(gòu)胚的激活方法及體細(xì)胞和重構(gòu)胚的重編程的處理方法進(jìn)行了研究。
　　 1、對(duì)轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚的激活方法進(jìn)行了模索。將電融合后的重構(gòu)胚隨機(jī)分成三組,分別在M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)0.5h、1.5h和2.5h后再進(jìn)行化學(xué)激活,探討融合-激活間隔時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)基因克隆重構(gòu)胚發(fā)育的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):隨著融合-激活間隔時(shí)間的延長(zhǎng),重構(gòu)胚的分裂率與囊胚率也逐漸增加,當(dāng)間隔時(shí)間延長(zhǎng)至2.5h時(shí),重構(gòu)胚的分裂率與

2、囊胚率顯著高于0.5h組(78.08％vs63.16％,31.51％vs17.11％,P＜0.05);將重構(gòu)胚用Ion激活5min后,放入含2mmol/L 6-DMAP和5μg/mL CHX的培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)1h、2h、3h,三組重構(gòu)胚的分裂率沒(méi)有顯著差異(P＞0.05),但囊胚率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)降低趨勢(shì),當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)到3h時(shí),囊胚率顯著低于1h組(13.89％vs28.57％,P＜0.05)。
　　 2、探討了TSA處理核移

3、植供體細(xì)胞或克隆重構(gòu)胚對(duì)兔轉(zhuǎn)基因克隆胚胎早期發(fā)育的影響。轉(zhuǎn)EGFP基因的兔胎兒成纖維細(xì)胞分別用濃度為5nmol/L、25 nmol/L、50nmol/L TSA處理24h后進(jìn)行核移植,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)TSA濃度為5nmol/L時(shí),重構(gòu)胚的分裂率和囊胚率顯著高于對(duì)照組(0nmol/L)(482.61％vs72.09％;41.30％vs26.74％,P＜0.05),而25nmol/L組與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異(P＞0.05),而濃度增加到50n

4、mol/L時(shí),重構(gòu)胚的分裂率與囊胚率顯著低于對(duì)照組(51.95％vs72.09％;11.69％vs26.74％,P＜0.05)。轉(zhuǎn)EGFP基因克隆重構(gòu)胚分別經(jīng)5nmol/L、50nmol/L、100nmol/L的TSA處理6h后發(fā)現(xiàn),50nmol/L組的重構(gòu)胚分裂率(84.09％)顯著高于對(duì)照組(70.24％)、5nmol/L(75.00％)組和100nmol/L組(71.76％)(P＜0.05),囊胚率(42.05％)顯著高于對(duì)照組(

5、27.38％)和100nmol/L組(25.88％)(P＜0.05)。用50nmol/L TSA分別處理重構(gòu)胚3h、6h、9h后,6h組的分裂率和囊胚率顯著高于對(duì)照組(83.17％vs70.51％;41.58％vs26.92％,P＜0.05),而3h、9h組與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。將196枚經(jīng)TSA處理過(guò)的轉(zhuǎn)基因兔體細(xì)胞克隆胚胎分別移植給10只受體兔,其中1只懷孕到期,產(chǎn)下2只克隆兔。
　　 以上結(jié)果表明:(1)兔