轉(zhuǎn)基因克隆兔的相關(guān)研究.pdf

1、供體細(xì)胞在體外培養(yǎng)的時(shí)間和培養(yǎng)代數(shù)對(duì)體細(xì)胞核移植效率有重要影響。本研究通過(guò)對(duì)5-10低代數(shù)組和20-25高代數(shù)組的兔成纖維細(xì)胞進(jìn)行核移植研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組供體細(xì)胞之間的核移植的效率存有差異。通過(guò)對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行核移植后的重構(gòu)胚胎的融合率、卵裂率、囊胚率以及體內(nèi)發(fā)育的比較，發(fā)現(xiàn)低代數(shù)相對(duì)來(lái)說(shuō)效率較高，但是高代數(shù)組也能獲得正常的克隆后代。本研究驗(yàn)證了兔不同代數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)克隆效率的影響，為制備基因打靶兔提供了理論依據(jù)和時(shí)間窗口。

2、>　　 體細(xì)胞核移植已經(jīng)成為制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的常用技術(shù)，體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率已經(jīng)成為制約轉(zhuǎn)基因效率的重要因素。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后按1:40和1:80兩個(gè)密度進(jìn)行稀釋，生長(zhǎng)至30％-40%匯合度時(shí)加入G418進(jìn)行篩選，最終共獲得細(xì)胞克隆41個(gè)，其中綠色熒光蛋白(GFP)陽(yáng)性細(xì)胞克隆12個(gè)，兩種稀釋密度均可獲得單細(xì)胞長(zhǎng)滿形成的GFP克隆，但低密度的效率更高，1:80可作為細(xì)胞篩選的適合密度。實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果為提高細(xì)胞

3、轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作的成功率提供了參考。
　　 胚胎冷凍保存已經(jīng)成為動(dòng)物保種，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎運(yùn)輸?shù)囊粋€(gè)必不可少的有效工具。玻璃化冷凍是一種快速冷凍方法，不需要特殊的設(shè)備。本研究將篩選出帶有綠色熒光的胚胎應(yīng)用玻璃化方法進(jìn)行冷凍并將非綠色熒光的胚胎篩選出來(lái)后也進(jìn)行玻璃化冷凍。將冷凍復(fù)蘇后形態(tài)完整的胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)，有47%的非GFP胚胎發(fā)育至囊胚。將復(fù)蘇的GFP轉(zhuǎn)基因桑椹胚移植到受體代孕母兔體內(nèi)，21%的胚胎發(fā)育為胎兒。最終，通過(guò)