體細(xì)胞克隆技術(shù)的若干改進(jìn)及其在轉(zhuǎn)基因克隆牛中的應(yīng)用.pdf

1、自從1997年世界首例體細(xì)胞克隆綿羊多莉誕生以來(lái)，體細(xì)胞核移植技術(shù)在多個(gè)物種中得以成功實(shí)踐。轉(zhuǎn)基因技術(shù)與體細(xì)胞克隆技術(shù)相結(jié)合是目前制備轉(zhuǎn)基因大動(dòng)物的主要手段。但由于克隆技術(shù)體系并不完善，至今仍未克服克隆效率低的問(wèn)題。而轉(zhuǎn)基因技術(shù)的介入，使得轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)又增加了更多的變數(shù)。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備過(guò)程中出現(xiàn)了很多問(wèn)題，如胚胎移植后妊娠率低、流產(chǎn)率高、胎兒發(fā)育異常、出生死亡率高等。而外源基因整合效率低，以及外源基因的沉默或丟失等現(xiàn)象更加制約了這項(xiàng)

2、技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。在總結(jié)了大量的前期工作的基礎(chǔ)上，我們對(duì)以牛為主的體細(xì)胞克隆體系進(jìn)行了系統(tǒng)的改進(jìn)與調(diào)整。包括卵母細(xì)胞的成熟、去核時(shí)間段的選擇、重構(gòu)胚激活處理方式、胚胎培養(yǎng)、受體母牛的發(fā)情狀態(tài)與胚胎發(fā)育時(shí)期的匹配等都進(jìn)行了改進(jìn)，形成了一套較為完整的牛體細(xì)胞克隆技術(shù)體系。利用改進(jìn)的技術(shù)體系開(kāi)展了大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因克隆牛生產(chǎn)。共完成對(duì)33043枚卵母細(xì)胞的去核與注核操作，得到融合胚胎26548枚，生產(chǎn)出各種轉(zhuǎn)基因克隆囊胚7519枚，規(guī)?；寺∧遗咝?/p>

3、率為28.3％。共移植受體牛1523頭，妊娠414頭，妊娠率為27.2％。通過(guò)將體細(xì)胞克隆技術(shù)的系統(tǒng)改進(jìn)與大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因克隆牛生產(chǎn)實(shí)踐相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)并盡可能地解決了克隆技術(shù)產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中的存在的一些問(wèn)題，對(duì)克隆及轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。
　　1、牛體細(xì)胞克隆技術(shù)的若干改進(jìn)與優(yōu)化
　　本研究對(duì)牛體細(xì)胞核移植的技術(shù)程序進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的改進(jìn)和優(yōu)化:兩步法培養(yǎng)卵母細(xì)胞、優(yōu)化了激活時(shí)間點(diǎn)、兩步激活處理等。結(jié)果顯示

4、:1）在成熟培養(yǎng)的第16h去除卵丘細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)至20-22h后進(jìn)行核移植操作，相比傳統(tǒng)的20-22h去除卵丘的一步培養(yǎng)法能顯著的提高去核率(95.1％vs74.3％，P＜0.05)和克隆胚胎的囊胚發(fā)育率(46.9％vs36.5％，P＜0.05)，并顯著降低了囊胚細(xì)胞的異常核型的比例(P＜0.05)。2)對(duì)融合后的重構(gòu)胚胎進(jìn)行免疫組化分析顯示，融合后的1h和2h，分別有96％和80％的胚胎染色體會(huì)出現(xiàn)早期染色體凝集。而3h至4h后這一

5、比例會(huì)降至50％以下，染色體也會(huì)漸漸擴(kuò)散或成拉長(zhǎng)的帶狀分布。當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)至5h-6h時(shí)，超過(guò)80％的胚胎會(huì)出現(xiàn)染色體四散漂移或分成幾部分的現(xiàn)象。因此我們將融合和激活的間隔時(shí)間控制在2h以內(nèi)。3）從成熟時(shí)間算起第22、24、25、26、27、28小時(shí)開(kāi)始激活重構(gòu)胚，發(fā)現(xiàn)26小時(shí)激活可以獲得最高的囊胚率。4）使用離子霉素對(duì)融合胚的兩次激活，顯著提高了克隆胚胎的發(fā)育率和后期妊娠率(50.5％vs35.6％，P＜0.05)。
　　2、克隆胚

6、胎的選擇與受體母牛發(fā)情狀態(tài)的匹配
　　本研究試圖通過(guò)選擇適宜發(fā)育階段的轉(zhuǎn)基因克隆胚胎與同期發(fā)情的受體合理匹配來(lái)提高妊娠率，降低流產(chǎn)率。研究結(jié)果顯示:1）試驗(yàn)中胚胎的發(fā)育速度不盡相同，在發(fā)育6、7、8、9天得到的囊胚中，發(fā)育六天的囊胚有著最高的孵化率(82.4％vs46.2％vs16.1％vs7.1％，P＜0.01)，囊胚質(zhì)量顯著提高。胚胎移植后的妊娠率也顯著高于其他組。2）為了探討轉(zhuǎn)基因克隆胚胎與受體最佳的匹配方式，將不同胚齡的胚

7、胎移植到發(fā)情6、7、8天的受體中，發(fā)現(xiàn)發(fā)情6天的受體移植早期囊胚和緊縮桑葚胚的妊娠率最高，發(fā)情7天的受體早期囊胚和囊胚的妊娠率最高，而發(fā)情8天的受體則更適合移植擴(kuò)張囊胚和孵化囊胚。3）為了找到最適合的移植胚胎數(shù)量，我們將1枚、2枚或3枚胚胎移植到同期發(fā)情受體中，45天妊檢發(fā)現(xiàn)移植1枚胚胎的妊娠率明顯偏低(57.9％vs69.8％vs71.4％，P＜0.05)，而移植2枚和3枚胚胎的受體會(huì)出現(xiàn)較高的早期流產(chǎn)率(P＜0.05)，從而造成其妊

8、娠到期率反而會(huì)低于移植1枚胚胎組(45.4％vs29.5％vs25.0％，P＜0.05)。4)對(duì)于冷凍胚胎的選擇結(jié)果顯示，玻璃化冷凍后相對(duì)于其他發(fā)育階段的胚胎，孵化囊胚的復(fù)蘇率最高可達(dá)到100％，而且還有著最高的移植妊娠率。
　　3、多不飽和脂肪酸去飽和酶基因（fat-1）的轉(zhuǎn)基因克隆牛制備
　　從線蟲(chóng)中分離篩選出fat-1基因，人源化處理后構(gòu)建成無(wú)篩選標(biāo)記的安全轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染奶牛胎兒成纖維細(xì)胞后，篩選出陽(yáng)性細(xì)胞作為核