轉基因體細胞克隆水牛與廣西水牛的遺傳特性研究.pdf

1、廣西大學博士學位論文轉基因體細胞克隆水牛與廣西水牛的遺傳特性研究姓名：崔奎青申請學位級別：博士專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖指導教師：石德順20070701穿孔能獲得更多的轉基因抗性細胞集落，轉染DNA的純度和細胞的狀態(tài)也明顯影晌脂質(zhì)體法的轉染效率。用含有GFP基因的線性化載體pCEEGFPIRESNeodNdB通過lipofectaminermooo轉染水牛nfl)L成纖維細胞，(3418篩選2周后挑取抗性細胞集落擴大培養(yǎng)，對轉染外源基因的

2、抗性細胞系的生物學特性進行了分析。結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過G418篩選后細胞增殖活力下降，細胞爬片liE染色后可看到細胞形態(tài)發(fā)生變化，凋亡分析發(fā)現(xiàn)部分抗性細胞表現(xiàn)出早期凋亡征狀，但染色體核型正常率與正常組相比差異不明顯。這些結果表明，轉染本身或隨后的篩選過程會對細胞造成一定的損害。從綿羊基因組擴增得到Bcasein基因啟動子區(qū)到第二內(nèi)含子區(qū)41kb的5’調(diào)控序列，從人基因組克隆得到人血小板生成素(TP0)基因長55kb的基因組序列，然后將啟動子和

3、TPO定向插入到ploxp骨架上。包含CMV超級啟動子的GFP片段從質(zhì)粒pCEEGFPIRESNeodNdB中獲得，并定向連接到ploxpCNTPO中。經(jīng)酶切、PCR鑒定，成功獲得了包含人TPO基因、綿羊13casein啟動子、GFP標記基因和新霉素抗性基因等長達20kb的轉基因載體ploxpEGFPCNTPO。通過脂質(zhì)體介導將構建好的載體線性化后導入水牛胎兒成纖維細胞中，G418篩選后得到35個抗性細胞集落，擴大培養(yǎng)后其中4個表達GF

4、P綠色熒光。經(jīng)PCR鑒定目的基因整合的完整性，發(fā)現(xiàn)1個為完整轉EGFPCNTPO基因陽性細胞集落。通過顯微操作、電融合的方法將陽性細胞移入體外成熟去核的水牛卵母細胞內(nèi)構建重組胚，囊胚率顯著低于對照組(P005)，說明供體細胞經(jīng)過基因轉染及長期體外培養(yǎng)篩選對克隆胚胎的早期發(fā)育有明顯影響；對轉基因體細胞構建核移植重組胚外源基因表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，綠色熒光蛋白開始表達于4細胞以后的重組胚，說明轉染的外源基因能夠在胚胎早期發(fā)育過程中表達。為研究廣