用于RNA干擾的質(zhì)粒載體的構(gòu)建及檢測(cè).pdf

1、 本課題的目的就在于構(gòu)建一種在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件下易于大量擴(kuò)增和應(yīng)用的RNA干擾載體，為后續(xù)在人類細(xì)胞中進(jìn)行各種RNA干擾研究奠定基礎(chǔ)。我們對(duì)克隆載體pUC19質(zhì)粒進(jìn)行了改造，使其可以在真核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并且具有新霉素抗性標(biāo)記，然后通過(guò)PCR從人類基因組中得到人U6snRNA啟動(dòng)子，將其連入經(jīng)過(guò)改造的pUC19中，構(gòu)建出RNA干擾質(zhì)粒pUC19NU。為了檢測(cè)該質(zhì)粒誘發(fā)的RNA干擾效應(yīng)，我們針對(duì)增強(qiáng)綠色熒光蛋白和p53蛋白的基因，分別設(shè)計(jì)了

2、兩段可以轉(zhuǎn)錄出短發(fā)夾環(huán)狀RNA的DNA模板序列，連入載體pUC19NU中，分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和KMB-17細(xì)胞。熒光顯微鏡下不同時(shí)段觀察HeLa細(xì)胞中增強(qiáng)綠色熒光蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的載體幾乎可以完全抑制細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)綠色熒光蛋白的表達(dá)，并且這種抑制作用是特異的。不同時(shí)間收集KMB-17細(xì)胞內(nèi)的蛋白，經(jīng)WesternBlot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的表達(dá)量較陰性對(duì)照組有顯著下降，說(shuō)明所構(gòu)建的載體對(duì)p53蛋白的表達(dá)也有良好的干擾