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1、原發(fā)性肝癌發(fā)生率高,手術(shù)切除是主要的治療方法,但肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率高,術(shù)后復(fù)發(fā)已成為影響患者預(yù)后的主要問題。肝癌侵襲轉(zhuǎn)移是主要的影響因素之一,深入研究肝癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)于改善肝癌患者的總體預(yù)后有重要作用。Rho家族屬于Ras超家族,是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子,在細(xì)胞的許多基礎(chǔ)生命活動(dòng)中起關(guān)鍵的作用。Rho蛋白和腫瘤發(fā)生有密切的關(guān)系,參與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程,目前研究證實(shí),在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、頭頸癌、肝癌等有RhoA表達(dá)的異常增高。本研究利用
2、RNA干擾技術(shù)干擾RhoA蛋白的表達(dá),干擾信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng),為進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞應(yīng)力纖維變化,變形、移動(dòng)、粘附和侵襲能力改變提供實(shí)驗(yàn)?zāi)P?,最后了解RhoA和肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 本研究主要包括以下兩個(gè)部分內(nèi)容: 第一部分:構(gòu)建干擾RhoA的shRNA真核表達(dá)載體。 目的:利用pGenesil-1質(zhì)粒構(gòu)建針對(duì)RhoA的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)表達(dá)載體。 方法:設(shè)計(jì)2個(gè)shR
3、NA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)DNA序列,經(jīng)退火成雙鏈,膠回收酶切pGenesil-1大片段,T4 DNA Ligase連接酶切大片段和DNA序列,得到質(zhì)粒pGenesl-1-siRhoA1和pGenesl-1-siRhoA2.轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a,擴(kuò)增,提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。 結(jié)果:成功構(gòu)建靶向RhoA的shRNA重組質(zhì)粒載體.經(jīng)酶切鑒定和DNA測(cè)序分析,shRNA編碼序列與設(shè)計(jì)的片段完全一致,證實(shí)重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。 結(jié)論:
4、表達(dá)靶向RhoA的shRNA表達(dá)框成功構(gòu)建在重組質(zhì)粒載體上。 第二部分:肝癌細(xì)胞中RhoA小干擾RNA載體的構(gòu)建與鑒定。 目的:構(gòu)建RhoA基因的RNA干擾(RNAi)載體。 方法:根據(jù)人RhoA基因序列設(shè)計(jì)兩條短雙鏈,人工合成后,連接到人真核表達(dá)載體Pgenesil-1中,構(gòu)成Pgenesil-1-siRhoA-1 ,Pgenesil-1-siRhoA-2兩個(gè)重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)人人肝癌細(xì)胞(HEPG2)細(xì)胞中,wes
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