家蠶核型多角體病毒(BmNPV)Bm61、orf74的基因分析.pdf

1、桿狀病毒是節(jié)肢動(dòng)物特別是鱗翅目昆蟲重要的病原微生物。到目前為止，已有47種桿狀病毒完成了全基因組測(cè)序。序列分析發(fā)現(xiàn)，僅有30個(gè)基因在所有已經(jīng)測(cè)序的桿狀病毒中都存在，稱為核心基因。在鱗翅目昆蟲桿狀病毒中，有62個(gè)基因是保守的。 本研究以家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)核心基因Bm61和非核心基因orf74為研究對(duì)象，從基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、亞細(xì)胞定位、病毒結(jié)構(gòu)定位、基因

2、缺失等方面，研究基因的基本特性及其功能，從而為豐富桿狀病毒分子生物學(xué)提供理論基礎(chǔ)。論文主要結(jié)論如下： 1．BmNPV的orf61(Bm61)位于基因組61，188——61，892 nt，全長(zhǎng)399bp，編碼一個(gè)含133個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測(cè)分子量約為15.5 kDa，Bm61是AcMNPV orf75的同源序列。在Bm61基因ATG上游存在桿狀病毒晚期轉(zhuǎn)錄基序ATAAG，在終止密碼子TAA下游發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)AATAAA。

3、 2．RT—PCR分析發(fā)現(xiàn)，Bm61在病毒感染宿主細(xì)胞12h開始轉(zhuǎn)錄，直到72h。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了BM61融合蛋白并制備了多克隆抗體。利用抗體進(jìn)行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)Bm61的表達(dá)產(chǎn)物在病毒感染宿主細(xì)胞后12 h被檢測(cè)出來，一直持續(xù)72 h都有表達(dá)，大小為15.5kDa，與預(yù)測(cè)的大小一致，說明Bm61是一個(gè)晚期表達(dá)基因，而且沒有轉(zhuǎn)錄后修飾。利用抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BM61定位在細(xì)胞核膜和細(xì)胞核內(nèi)周。 3．利用

4、phageλRed重組酶和Bac—to—Bac系統(tǒng)，在家蠶核型多角體病毒Bacmid中成功敲除Bm61基因。缺失Bm61的Bacmid轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，只有少量的細(xì)胞熒光，說明缺失Bm61導(dǎo)致病毒在細(xì)胞間的傳染出現(xiàn)異常。PCR顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清中沒有BV產(chǎn)生，而Bm61的拯救病毒表現(xiàn)出和野生病毒相同的特性。證明Bm61是BV產(chǎn)生的必需基因。進(jìn)一步分析Bm61缺失不影響病毒基因組復(fù)制和gp64的轉(zhuǎn)錄。 4．0rf74位于BmNPV基因組

5、的69，987—70，449 nt之間，全長(zhǎng)462 bp，編碼154個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量大約為17.3 kDa。在orf74基因ATG上游9nt處有一個(gè)桿狀病毒晚期轉(zhuǎn)錄基序TTAAG。orf74是AcMNPVorf91的同源序列， 5．0rf74的轉(zhuǎn)錄分析表明，orf74從病毒感染后12h開始轉(zhuǎn)錄，一直持續(xù)到96h，可能是一個(gè)晚期表達(dá)基因。利用ORF74與GFP融合對(duì)其亞細(xì)胞定位進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)ORF74的表達(dá)集中在細(xì)胞核。