家蠶核型多角體病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及宿主特異性研究.pdf

1、家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）是家蠶血液型膿病病原，對(duì)家蠶幼蟲產(chǎn)生致死性的感染，該病是養(yǎng)蠶業(yè)常見且危害較大的一種病毒病。廣西地處亞熱帶地區(qū)，具有明顯的氣候優(yōu)勢(shì)，過去幾年中廣西蠶桑業(yè)得到迅猛發(fā)展，然而，由于養(yǎng)殖密度大，生產(chǎn)期較長(zhǎng)，往往容易造成蠶病特別是病毒性傳染病的流行。廣西幾乎每年都會(huì)出現(xiàn)BmNPV的流行，而且這些年來由于養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大以及病原體在養(yǎng)蠶區(qū)不斷積累，Bm

2、NPV流行顯示出逐漸加劇的趨勢(shì)，給廣西養(yǎng)蠶業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了廣西養(yǎng)蠶業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，對(duì)廣西各地BmNPV流行情況進(jìn)行調(diào)查，了解病毒傳播特點(diǎn)，將有助于制定相應(yīng)措施遏制BmNPV在養(yǎng)蠶區(qū)擴(kuò)大化流行。
　　 本研究從廣西各養(yǎng)蠶區(qū)分別收集了45個(gè)野生BmNPV分離毒株，對(duì)這些分離株的唯一兩個(gè)極晚期表達(dá)基因多角體蛋白polh基因和微管相關(guān)蛋白p10基因進(jìn)行克隆測(cè)序，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。序列分析結(jié)果顯示，polh基因高度保守，而p10

3、基因變異較大，頻繁出現(xiàn)核苷酸點(diǎn)突變，表現(xiàn)出密碼子使用多樣化，并沒有明顯的密碼子偏好。根據(jù)p10基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，廣西BmNPV分離株主要分為三個(gè)群cladesⅠ、Ⅱ和Ⅲ。廣西BmNPV分離株的地理分布顯示，cladeⅠ和Ⅱ分群中的分離株來源地域較為集中而且毗鄰，提示在這些區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)局部的流行與傳播。cladeⅢ的分離株呈不規(guī)律分布于廣西各地，提示有可能發(fā)生遠(yuǎn)距離的病毒傳播。廣西桑蠶資源豐富，蠶蟲或者蠶蛹可以作為一種理想的生物反應(yīng)器，利

4、用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在其中大量生產(chǎn)重組蛋白，不僅省時(shí)省力而且經(jīng)濟(jì)節(jié)約?？袢〔《咎堑鞍?Rabies virus glycoprotein，RVG)是主要保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體。本研究使用了一個(gè)經(jīng)過基因工程改良的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，即與BmNPV基因組同源的bacmid缺失了幾丁質(zhì)酶和半胱氨酸酶基因，構(gòu)建了攜帶RVG基因的重組bacmid，同時(shí)引入在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄活性的巨細(xì)胞瘤病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子CMV-IE序列。將重組

5、bacmid與脂質(zhì)體混合注射家蠶幼蟲血腔，進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染獲得重組桿狀病毒。鑒定結(jié)果顯示，重組RVG在蠶蟲機(jī)體組織中獲得大量表達(dá)，重組表達(dá)的RVG最終定位于細(xì)胞質(zhì)膜，重組RVG分子量略小于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的天然RVG。但是，多個(gè)抗RVG單克隆抗體皆與之發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)的程度與天然RVG的基本一致，提示重組RVG的結(jié)構(gòu)和功能是完好的。針對(duì)BmNPV宿主特異性研究表明，無論是體內(nèi)還是體外BmNPV的宿主域相當(dāng)狹窄。草地夜蛾(Spodopte

6、ra frugiperda，Sf)細(xì)胞系Sf9一直被認(rèn)為是BmNPV的非受納細(xì)胞系，BmNPV不能在其中進(jìn)行有效的復(fù)制增殖。本研究中，兩個(gè)攜帶有外源報(bào)告基因的重組BmNPV，即攜帶狂犬病病毒RVG基因及巨細(xì)胞瘤病毒啟動(dòng)子CMV-IE序列的rBm-PCMV-RVG和攜帶綠色熒光蛋白GFP基因的rBm-GFP，被構(gòu)建并表現(xiàn)出對(duì)Sf9細(xì)胞具有感染性。該重組BmNPV可以在Sf9細(xì)胞中復(fù)制增殖，被感染的Sf9細(xì)胞無明顯細(xì)胞病變，顯示一種無癥狀溫

7、和型的感染狀態(tài)，并且在被感染的Sf9細(xì)胞上可以檢測(cè)到由低pH值引發(fā)的膜融合反應(yīng)。以重組rBm-GFP接種Sf9細(xì)胞，GFP熒光灶形成和子代病毒滴度增加證實(shí)了病毒可以從Sf9細(xì)胞中出芽。然而，只有在接種病毒量較大時(shí)，重組BmNPV才能在Sf9細(xì)胞中復(fù)制增殖，且增殖過程與其在受納家蠶細(xì)胞系BmN中增殖過程不同;而當(dāng)接種病毒量較小時(shí)，重組BmNPV在Sf9細(xì)胞中產(chǎn)生頓挫感染。另外，重組rBm-GFP在Sf9細(xì)胞中經(jīng)過系列傳代后顯示出比傳代前的

8、原始病毒復(fù)制能力更強(qiáng)。
　　 本文根據(jù)GenBank發(fā)表的家蠶抗BmNPV病毒脂肪酶基因Bmlipase-1和絲氨酸蛋白酶基因BmSP-2序列，分別設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，以廣西優(yōu)良家蠶品系“兩廣二號(hào)”為實(shí)驗(yàn)材料，成功克隆了該品系家蠶兩個(gè)抗病毒基因的完整開放閱讀框(open reading frame，ORF)，測(cè)序并與不同蠶來源的同源基因序列進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:“兩廣二號(hào)”家蠶Bmlipase-1基因ORF長(zhǎng)度是885bp，編碼29

9、4個(gè)氨基酸，BmSP-2基因ORF長(zhǎng)度是855bp，編碼284個(gè)氨基酸;同源性比較表明二者與其他品系家蠶甚至野蠶和蓖麻蠶的同源序列高度保守，核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性皆在92％以上，其中Bmlipase-1更為保守，同源性達(dá)到99％以上;序列分析發(fā)現(xiàn)各種蠶來源的Bmlipase-1基因脂肪酶活化部位(GXSXG，X為任一氨基酸)的氨基酸序列完全一致，BmSP-2基因酶催化三聯(lián)體(His95，Asp142，Ser236)位點(diǎn)及附近氨基