斜紋夜蛾核多角體病毒bro和iap基因的研究.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文斜紋夜蛾核多角體病毒bro和iap基因的研究姓名：龔映雪申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：龐義20050602能檢測(cè)到相應(yīng)大小的特異蛋白帶；BRO—B從感染后12h即有高豐度表達(dá)，并一直持續(xù)到96h。間接免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，SpltMNPVBRO—B蛋白特異性地分布于感染病毒的細(xì)胞核中；對(duì)感染SpltMNPV病毒的細(xì)胞進(jìn)行核組分的分離抽提發(fā)現(xiàn)，BROB能夠與細(xì)胞核發(fā)生緊密的結(jié)合，可能是～個(gè)新的DNA結(jié)合蛋白。細(xì)

2、胞凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein)／ap基因在從桿狀病毒到人類的各個(gè)物種中廣泛存在，組成了一個(gè)多功能、參與多種細(xì)胞途徑的調(diào)控蛋白家族。本文通過(guò)計(jì)算機(jī)分析SpltMNPV／ap序列發(fā)現(xiàn)，其氨基端只具有一個(gè)桿狀病毒／ap重復(fù)模序(BIER模序)，其羧基端具有一個(gè)RING模序，在兩者之間存在一個(gè)Asp富集區(qū)；SpltMNPVIAP與其它桿狀病毒lAP蛋白的同源性普遍高于與細(xì)胞來(lái)源的IAP蛋白。用PCR方法

3、擴(kuò)增得到／ap全部編碼區(qū)并克隆到原核表達(dá)載體pQE30上，在IFIG誘導(dǎo)下高效表達(dá)了相應(yīng)分子量大小的6His1AP融合蛋白。純化的融合蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，制備了anti—IAP多克隆抗體。用病毒感染后不同時(shí)間的斜紋夜蛾細(xì)胞進(jìn)行RTPCR分析表明，在離體條件下／ap基因的轉(zhuǎn)錄從病毒感染后12h持續(xù)到感染后96h；與之相應(yīng)，用lAP抗體進(jìn)行Western印跡，從感染后12h到96h能檢測(cè)到分子量為32kDa的特異蛋白條帶表達(dá)；從感

4、染后48h到96h還能檢測(cè)到分子量為16kDa的特異蛋白帶，推測(cè)分別是IAP表達(dá)蛋白形成的二聚體和單體形式。通過(guò)間接免疫熒光分析結(jié)合Western印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SpltMNPVlAP蛋白僅分布于感染病毒的細(xì)胞核中。通過(guò)構(gòu)建帶有苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifomicamulticapsidnucleopolyhedrovirus，AcMNPV)／e』基因啟動(dòng)子和SpltMNPV／ap基因全部編碼區(qū)及poly(A)

5、加尾酶信號(hào)序列的瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pTPieliap，并轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾細(xì)胞Sf9進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用lAP抗體進(jìn)行Westernblot印跡能檢測(cè)到蛋白表達(dá)；用AcMNPV缺失p35基因的自然突變株vAcAnh感染Sf9細(xì)胞，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在感染后24小時(shí)，不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)染pTPieliap的細(xì)胞沒(méi)有凋亡現(xiàn)象出現(xiàn)；在感染后48小時(shí)，不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞大部分出現(xiàn)晚期凋亡及壞死現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染pTPi