甜菜夜蛾核多角體病毒在Se301細胞中的持續(xù)感染研究.pdf

1、桿狀病毒是一類雙鏈環(huán)狀DNA病毒，可特異性地感染包括許多重要農(nóng)業(yè)經(jīng)濟害蟲在內(nèi)的節(jié)肢動物。桿狀病毒持續(xù)感染在野外昆蟲宿主種群中普遍存在。在某些條件刺激下，持續(xù)感染可轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋承愿腥?，并引發(fā)流行病。因此，桿狀病毒持續(xù)感染對昆蟲種群動力學以及病毒流行病學的研究具有重要意義。但是，目前仍未建立一個較好的病毒-宿主模型來研究桿狀病毒持續(xù)感染的機制。本論文以甜菜夜蛾核多角體病毒(SeMNPV)及其宿主細胞Se301作為研究對象，首次建立了SeMNP

2、V持續(xù)感染的Se301細胞系，并從中克隆了一株不產(chǎn)生可感染性病毒但可抑制SeMNPV感染的細胞株，為研究桿狀病毒在昆蟲細胞中持續(xù)感染的分子機制奠定了基礎(chǔ)。
　　 雖然SeMNPV感染Se301細胞最終導致細胞裂解死亡，但當SeMNPV在Se301細胞中無稀釋連續(xù)傳代時，其子代病毒感染性逐漸降低。本研究中，在Se301細胞中無稀釋傳至第8代的SeMNPV感染Se301細胞后，少量細胞能夠存活，并保持增殖能力。我們將該細胞系命名為P

3、8-Se301。P8-Se301細胞群體生長速度慢于Se301細胞，4.14±0.99％的細胞可持續(xù)釋放可感染性的芽生型病毒，部分細胞中可見多角體和病毒發(fā)生基質(zhì)等病毒感染特征。SeMNPV感染P8-Se301細胞，細胞的病理現(xiàn)象沒有明顯增加；芽生型病毒和多角體總數(shù)的產(chǎn)量與未感染P8-Se301細胞的類似。P8-Se301細胞釋放的子代病毒vP8-Se301與SeMNPV共同感染Se301細胞后，其病毒滴度較野生型SeMNPV感染細胞所產(chǎn)

4、生的滴度低，表明vP8-Se301對SeMNPV具有干擾作用。Dot blot分析表明，提取的P8-Se301總DNA中的0.21％為SeMNPV的基因組成分。Southern blot和PCR分析表明，雖然P8-Se301細胞的胞內(nèi)病毒基因組包含了大部分SeMNPV基因組片段，但仍缺失了部分SeMNPV基因組片段。實時熒光定量PCR測定表明，在每個P8-Se301細胞中平均含有(4.40±2.14)×103個SeMNPV多角體蛋白基因

5、(polh)拷貝。RT-PCR可檢測到P8-Se301細胞中SeMNPV極早期基因ie-0、早期基因dnapol、晚期基因orf67和極晚期基因polh的轉(zhuǎn)錄本。以上結(jié)果證實了P8-Se301細胞是一株SeMNPV持續(xù)感染的細胞。
　　 利用單細胞克隆方法，從P8-Se301細胞中得到一株細胞克隆，命名為P8-Se301-C1。P8-Se301-C1細胞形態(tài)與Se301細胞相似，細胞中未見多角體和病毒發(fā)生基質(zhì)等病毒感染特征。但與

6、P8-Se301一樣，其細胞群體生長速度較Se301細胞的慢。TCID50終點稀釋法和感染中心測定表明，P8-Se301-C1細胞不產(chǎn)生可感染性病毒。SeMNPV感染P8-Se301-C1細胞的子代病毒產(chǎn)量較其感染Se301的顯著下降，表明P8-Se301-C1細胞具有抑制SeMNPV復制的能力。實時熒光定量PCR分析表明，在SeMNPV感染細胞1h內(nèi)，進入P8-Se301-C1細胞和Se301細胞中的病毒數(shù)量無顯著性差異；但Dot b

7、lot分析表明，在SeMNPV感染6h時或之前，其DNA復制在P8-Se301-C1細胞中受到抑制，證明P8-Se301-C1細胞對SeMNPV感染的干擾作用是發(fā)生在病毒進入細胞后，DNA復制時或復制前的早期感染階段。以提取的P8-Se301-C1細胞的總DNA為模板，PCR可擴增得到SeMNPV ie-0和polh基因片段，但不能得到dnapol和orf67基因片段，表明P8-Se301-C1細胞中含有不完整的SeMNPV基因組。Do

8、t blot分析表明，1.25×105個P8-Se301-C1細胞中含有0.32±0.16 ng SeMNPV DNA。實時熒光定量PCR表明，單個P8-Se301-C1細胞中SeMNPV polh基因的拷貝數(shù)為13.24±4.27。巢式RT-PCR可檢測到P8-Se301-Cl1細胞中的SeMNPV polh基因轉(zhuǎn)錄本。以上結(jié)果表明P8-Se301-C1含有少量不完整的SeMNPV基因組，但不產(chǎn)生子代病毒，說明該細胞可能存在SeMNP