SpltNPV感染甜菜夜蛾幼蟲的病理學(xué)研究.pdf

1、斜紋夜蛾(Spodoptera litura)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)同屬夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾屬(Spodoptera)，均為重要的農(nóng)作物害蟲。斜紋夜蛾核多角體病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPV)和甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus，SeMNPV)分別是

2、控制這兩種害蟲種群的重要生物因子，它們的基因組序列測(cè)定和分析工作已經(jīng)完成。雖然兩種病毒的基因組相似程度很高，兩種宿主的親緣關(guān)系很近，但是初步研究表明甜菜夜蛾是SpltNPV的非受納宿主。SpltNPV在甜菜夜蛾中復(fù)制失敗的原因不明。本研究首次在個(gè)體水平、組織水平和分子水平上對(duì)SpltNPV口服感染甜菜夜蛾幼蟲的病理學(xué)進(jìn)行了深入研究和探討。 用不同濃度的SpltNPV包涵體(occlusion body,OB)口服感染甜菜夜蛾二

3、齡幼蟲，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加，病毒對(duì)幼蟲的致病性增強(qiáng)。當(dāng)用10<'6> OBs/ml的SpltNPV感染時(shí)，受毒幼蟲并沒有顯示出任何桿狀病毒致病特征，能夠正常生長發(fā)育直到至化蛹。用10<'7> OBs/ml的SpRNPV感染，受毒幼蟲10天時(shí)的死亡率為29.1﹪；用10<'8>OBs/ml的SpltNPV感染，受毒幼蟲6天時(shí)的死亡率為70.9﹪。用高至10<'9>OBs/ml的SpltNPV感染，受毒幼蟲96 h時(shí)的死亡率為10.5﹪，1

4、20 h時(shí)的死亡率為61.9﹪，到144h，死亡率達(dá)到84.8﹪；在受毒96 h時(shí)，沒有感染病毒的幼蟲體長和體重分別是感染病毒幼蟲的1.46倍和1.92倍。但是所有死亡幼蟲的蟲尸均不液化，蟲尸液化是受桿狀病毒感染致死幼蟲的典型特征。以上結(jié)果說明，高濃度的SpltNPV可使低齡(二齡)甜菜夜蛾幼蟲產(chǎn)生非典型的桿狀病毒感染癥狀。 用10<'9>OBs/ml的高濃度SpltNPV感染不同齡期的甜菜夜蛾幼蟲，發(fā)現(xiàn)高齡幼蟲對(duì)SpRNPV

5、的抵抗力大于低齡幼蟲。受毒的三齡幼蟲生長非常緩慢，少量受毒幼蟲10天后死亡，蟲尸不液化。四齡受毒幼蟲沒有顯示出罹病的癥狀，并能正常蛻皮、生長直至化蛹。為了研究SpltNPV能否在甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)復(fù)制和為了確定病毒基因表達(dá)是否在極早期、早期、晚期或極晚期被阻斷，用RT-PCR法對(duì)受毒幼蟲總RNA中不同表達(dá)時(shí)期的病毒基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了檢測(cè)。設(shè)計(jì)了四對(duì)引物可分別檢測(cè)SpltNPV的ie-O基因(極早期基因)、DNAAZymerase基因(早期基

6、因)、chitinase基因(晚期基因)和polyhedrin基因(極晚期基因)。結(jié)果顯示，在SpltNPV感染甜菜夜蛾二齡幼蟲6h時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)ie-O基因的轉(zhuǎn)錄，但是在12和24h均有轉(zhuǎn)錄，和SpltNPV感染的受納宿主斜紋夜蛾幼蟲體內(nèi)的ie-O相比，該基因轉(zhuǎn)錄延遲且轉(zhuǎn)錄本的量減少。同時(shí)對(duì)DNApolymerase基因，chitinase基因和polyhedrin基因的檢測(cè)顯示這三個(gè)基因均在甜菜夜蛾二齡幼蟲的體內(nèi)有轉(zhuǎn)錄，但是這三個(gè)基因

7、轉(zhuǎn)錄本的豐度要比在SpltNPV感染斜紋夜蛾幼蟲中的低。以上結(jié)果說明，SpltNPV各個(gè)轉(zhuǎn)錄時(shí)期的基因均能在甜菜夜蛾幼蟲中完成轉(zhuǎn)錄。 由于高濃度SpltNPV僅使三齡甜菜夜蛾幼蟲部分死亡，我們利用該齡幼蟲研究了甜菜夜蛾阻斷SpltNPV成功感染的可能因素。取受毒96 h時(shí)的幼蟲血淋巴在光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)幼蟲血細(xì)胞有出泡現(xiàn)象，同時(shí)血細(xì)胞DNA電泳呈現(xiàn)ladder條帶，顯示出細(xì)胞凋亡的特征。將受毒幼蟲用福爾馬林固定、石蠟包埋、切

8、片、HE染色觀察，發(fā)現(xiàn)受毒幼蟲脂肪體中有很多孔洞和巢穴，這可能是由于部分細(xì)胞因病毒感染而產(chǎn)生了病理變化，病變細(xì)胞從組織中解體或脫落然后被周圍細(xì)胞吞噬所導(dǎo)致。Hamm’s方法染色發(fā)現(xiàn)，被染成微弱紅色的細(xì)胞零散地分布在幼蟲脂肪體細(xì)胞中，表明該組織中可能有病毒多角體蛋白的合成。TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，受毒幼蟲脂肪體組織出現(xiàn)大量的TZINEL，陽性細(xì)胞，DAPI復(fù)染的實(shí)驗(yàn)證實(shí)大部分TUNEL，染色陽性細(xì)胞的細(xì)胞核濃縮或者片斷化，說明脂肪體細(xì)胞發(fā)生了

9、細(xì)胞凋亡。用病毒基因組DNA作探針進(jìn)行原位雜交檢測(cè)的結(jié)果顯示，在脂肪體組織中有弱的陽性信號(hào)，證實(shí)了斜紋夜蛾核多角體病毒已經(jīng)進(jìn)入了該區(qū)域。以上研究說明受毒甜菜夜蛾幼蟲脂肪體細(xì)胞因SpltNPV的感染而發(fā)生了細(xì)胞凋亡，暗示細(xì)胞凋亡可能是阻斷SpltNPV在甜菜夜蛾幼蟲中復(fù)制的一個(gè)重要因素。 我們用高濃度的SpltNPV感染甜菜夜蛾四齡幼蟲，并用終點(diǎn)稀釋法進(jìn)行檢測(cè)，為了解受毒幼蟲血淋巴中是否存在SpltNPV子代芽生型病毒(budd

10、ed virus，BV)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受毒48h時(shí)，受毒幼蟲血淋巴中有SpltNPV BV產(chǎn)生，72h時(shí)病毒滴度保持了與48 h時(shí)同樣的水平，而96 h時(shí)BV滴度下降，說明甜菜夜蛾高齡幼蟲的血淋巴中存在阻斷SpltNPV復(fù)制的重要因素。本研究第一次證實(shí)了桿狀病毒經(jīng)口服感染途徑，即病毒感染昆蟲的自然途徑可導(dǎo)致非敏感寄主的部分組織細(xì)胞凋亡，從而證實(shí)了細(xì)胞凋亡是限制桿狀病毒宿主范圍的一個(gè)重要影響因子，為闡明細(xì)胞凋亡與宿主特異性之間的關(guān)系，以及通