創(chuàng)傷弧菌感染的實驗病理學(xué)及細菌學(xué)研究.pdf

1、目的：創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus，Vv)感染是海上創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)中的重要問題，也是海產(chǎn)品食品衛(wèi)生中的重要問題。為闡明嚴重創(chuàng)傷弧菌感染致小鼠快速死亡的原因，為揭示創(chuàng)傷弧菌對小鼠胃腸道的致病性，為闡明在海水環(huán)境下創(chuàng)傷弧菌經(jīng)皮膚傷口引起組織感染的病理學(xué)變化特點及感染組織中的細菌增殖動力學(xué)特點，我們進行了本項研究，為臨床創(chuàng)傷弧菌感染的診治提供一定的理論依據(jù)。 方法：一、創(chuàng)傷弧菌一般特性觀察及毒力實驗研究：創(chuàng)傷弧菌標準株，編號1

2、.1758，購自中國科學(xué)院微生物研究所普通微生物保藏管理中心。復(fù)蘇培養(yǎng)后，行革蘭氏染色，光鏡觀察，劃線接種于硫代硫酸鹽—枸櫞酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂(thiosulfate-cifrate-bilesalt-sucrose，TCBS)平板及普通營養(yǎng)瓊脂平板觀察其菌落形態(tài)，并接種于生化管觀察其生化特性，最后在電鏡下觀察其超微形態(tài)結(jié)構(gòu)特點。毒力實驗：實驗組15只腹腔注射創(chuàng)傷弧菌菌液，以5只小鼠腹腔注射滅菌培養(yǎng)基為對照。觀察小鼠一般情況，對小鼠血

3、液和主要臟器進行創(chuàng)傷弧菌的分離培養(yǎng)，并對主要臟器進行病理學(xué)觀察，結(jié)合生化特性及形態(tài)結(jié)構(gòu)特點判斷其毒力如何。 二、創(chuàng)傷弧菌對小鼠消化道的致病性研究：通過強制性喂食創(chuàng)傷弧菌菌液建立該菌經(jīng)口攝入感染小鼠的動物模型，分別以喂食霍亂弧菌菌液和滅菌培養(yǎng)基作陽性和空白對照；通過堿性溶液灌胃的方式建立抗胃酸作用后創(chuàng)傷弧菌經(jīng)口攝入感染小鼠的動物模型，以堿性溶液灌胃后喂食滅菌培養(yǎng)基作對照。觀察小鼠一般情況，并收集糞便進行創(chuàng)傷弧菌的分離培養(yǎng)。分別于實

4、驗后不同時段處死小鼠后取其食管、胃及腸組織進行病理學(xué)觀察，同時進行創(chuàng)傷弧菌分離培養(yǎng)，并取胃組織進行掃描電鏡觀察。另外體外用酸處理該菌后，行增菌培養(yǎng)以及在光鏡和透射電鏡下觀察其菌體的改變。 以105-1012(cfu/L)8種不同濃度級的創(chuàng)傷弧菌菌液強制性喂食實驗組小鼠，對照組6只小鼠喂食滅菌培養(yǎng)基。觀察小鼠一般情況，于實驗后12h處死所有小鼠，取其食管、胃及腸組織進行病理學(xué)觀察，同時進行創(chuàng)傷弧菌分離培養(yǎng)。以胃粘膜損傷為判斷該菌對

5、小鼠胃組織致病的標準，得出創(chuàng)傷弧菌1.1758株對小鼠胃組織致病濃度范圍。 三、經(jīng)由皮膚傷口感染創(chuàng)傷弧菌后局部組織的細菌感染學(xué)及病理學(xué)研究：無菌致傷小鼠后將其浸泡于含有創(chuàng)傷弧菌的滅菌人工海水中，建立海水環(huán)境下經(jīng)由皮膚傷口接觸創(chuàng)傷弧菌造成感染的動物模型，并建立非海水環(huán)境下經(jīng)由皮膚傷口接觸創(chuàng)傷弧菌造成感染(無菌制傷小鼠后浸泡于含有創(chuàng)傷弧菌的滅菌生理鹽水中)動物模型和傷口單純浸泡海水動物模型以及單純無菌致傷動物模型進行對照分析。確定局

6、部組織中感染細菌種類及細菌感染類型，并在不同時相(0h、6h、12h、24h)對組織中所含細菌進行定量研究并作統(tǒng)計學(xué)分析，用曲線擬合及直線回歸的方法建立感染組織中細菌增殖動力學(xué)模型，在此基礎(chǔ)上計算感染臨界時限；對局部肌組織進行取材、制片和HE染色，作病理學(xué)觀察。 結(jié)果：一、創(chuàng)傷弧菌1.1758株在固體培養(yǎng)基上生長為典型粘液(M)型菌落，乳糖發(fā)酵陰性，人工培養(yǎng)條件下未見莢膜層。 二、創(chuàng)傷弧菌原發(fā)性敗血癥致小鼠多臟器損傷，尤

7、以肺和腎臟的損傷最為嚴重。肺損傷以出血性病變?yōu)橹?，支氣管部分上皮粘膜脫落，管腔?nèi)可見脫落的上皮細胞及數(shù)量較多的紅細胞，并可見吞噬含鐵血黃素顆粒的巨噬細胞；肺間質(zhì)內(nèi)可見大量紅細胞，血管擴張充血，肺泡上皮脫落，肺泡腔內(nèi)可見粉紅色滲出液。腎臟損傷同樣以出血性病變?yōu)橹鳎也∽兯栀|(zhì)較皮質(zhì)更為嚴重，間質(zhì)內(nèi)可見大量紅細胞；腎小球病變較輕微，腎小管上皮細胞出現(xiàn)顆粒樣變性甚至空泡變性，部分上皮細胞完全崩解，細胞壞死，可見核固縮。 三、在正常胃內(nèi)環(huán)

8、境下，創(chuàng)傷弧菌經(jīng)食管感染小鼠后并未導(dǎo)致其出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等消化道癥狀，且該菌的分離培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，但病理學(xué)及掃描電鏡結(jié)果顯示實驗組小鼠胃粘膜表面附著有極度腫脹變形的創(chuàng)傷弧菌菌體，且附著處部分胃粘膜上皮細胞脫落、溶解壞死。酸處理過的創(chuàng)傷弧菌培養(yǎng)物菌體腫脹變形甚至破裂。創(chuàng)傷弧菌1.1758株致小鼠胃組織損傷的濃度范圍為108cfu/L～109cfu/L。 四、抗胃酸作用后，創(chuàng)傷弧菌經(jīng)食管感染小鼠后同樣未導(dǎo)致其出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等消化道癥

9、狀，但該菌的分離培養(yǎng)結(jié)果部分為陽性，病理學(xué)及掃描電鏡結(jié)果顯示實驗組小鼠胃粘膜表面附著的創(chuàng)傷弧菌菌體部分相對正常，未發(fā)生變形和腫脹。胃粘膜損傷明顯，并且對腸道組織也造成了損傷：腸組織各層中均可見數(shù)量不等的中性粒細胞浸潤，小腸粘膜腺體間隙增大，間質(zhì)疏松水腫，且部分大腸組織肌層中性粒細胞散在浸潤處可見肌纖維的變性、斷裂和溶解，但腸粘膜完整平滑，也未見水腫。此外，抗胃酸作用后的小鼠胃組織粘膜表面粘液減少。 五、海水菌液浸泡組混合感染細菌

10、的種類要比生理鹽水菌液浸泡組多，而浸泡創(chuàng)傷弧菌菌液的兩組混合感染細菌種類又比單純海水浸泡組和單純致傷組要多。 六、海水菌液浸泡組及生理鹽水菌液浸泡組兩組小鼠創(chuàng)傷組織中的細菌總數(shù)均隨時間的延長而增多，且除0h外，海水菌液浸泡組同一時相的細菌總數(shù)均比生理鹽水菌液浸泡組高。0h時，兩組小鼠每克組織中的創(chuàng)傷弧菌數(shù)量沒有顯著性差異(P=0.664)，但隨著時間延長，海水菌液浸泡組小鼠創(chuàng)傷組織中創(chuàng)傷弧菌增殖更快。兩組創(chuàng)傷組織中的細菌總數(shù)在對

11、數(shù)坐標圖上均呈直線式上升，但是表示海水菌液浸泡組細菌增殖直線的斜率比生理鹽水菌液浸泡組要大，這同樣表示海水菌液浸泡組小鼠創(chuàng)傷組織中創(chuàng)傷弧菌增殖更快。 七、用曲線擬合及直線回歸的方法建立接觸創(chuàng)傷弧菌感染組織中細菌增殖動力學(xué)模型，分別為： Y(1)=e(6.9893+0.5672X)…………………………………………………(1)Y(2)=e(7.2212+0.3772X)…………………………………………………………………………

12、……………………………………………………………………………(2)lgY=3.0154+0.2506x………………………………………………………………………………………………………………………………………………………(3)lgY=3.3160+0.1638x………………………………………………………………………………………………………………………………………………………(4)式中，X為時相，Y為每克組織中的細菌含量(個/每克組織)。式(1

13、)和(2)為用曲線擬合的方法得出的細菌增殖動力學(xué)模型；式(3)和(4)為用直線回歸的方法得出的細菌增殖動力學(xué)模型；式(1)和(3)代表海水菌液浸泡組，式(2)和(4)代表生理鹽水菌液浸泡組。對四個回歸方程行顯著性檢驗，結(jié)果均有顯著性意義，P＜0.05。 八、根據(jù)細菌增殖動力學(xué)模型，計算出海水環(huán)境下接觸創(chuàng)傷弧菌達到感染臨界的時限為7.98h，比生理鹽水環(huán)境下接觸創(chuàng)傷弧菌達到感染臨界提前了近3.4h。 九、海水菌液浸泡組及生

14、理鹽水菌液浸泡組小鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹部顫抖、弓背、毛發(fā)豎立、體溫升高、進食減少、少動喜蜷縮等情況，且持續(xù)時間長，死亡或活殺前上述情況都未好轉(zhuǎn)或減輕。從7只海水菌液浸泡組小鼠血液中分離出創(chuàng)傷弧菌，其主要臟器也出現(xiàn)不同程度的損傷。 十、海水菌液浸泡組創(chuàng)傷組織的損傷最為嚴重：0h時，可見肌纖維的變性、溶解和斷裂，但炎癥反應(yīng)不明顯；12h時肌組織溶解壞死更加明顯，肌間隙增寬，滲出及出血明顯，并伴有大量中性粒細胞浸潤；24h時，肌組織大片

15、徹底溶解壞死，膿腔形成?？傮w來講，創(chuàng)傷弧菌感染兩組要比未感染兩組病變嚴重，而組織修復(fù)過程也要緩慢。海水菌液浸泡組病變最為嚴重，脫離浸泡后24h時仍無好轉(zhuǎn)趨勢，并且創(chuàng)傷弧菌還經(jīng)傷口入血，引起敗血癥。 結(jié)論：一、乳糖是否發(fā)酵不能作為創(chuàng)傷弧菌鑒定的決定性指標，在用弧菌生化編碼鑒定管對未知弧菌進行鑒定時，不能僅僅依靠生化特性的結(jié)果，還應(yīng)結(jié)合菌落形態(tài)、革蘭氏染色形態(tài)等特點進行綜合考慮。 二、創(chuàng)傷弧菌1.1758株具有較強的毒力，但

16、對消化道的致病性較弱。三、創(chuàng)傷弧菌1.1758株感染小鼠后能被吸收入血，引發(fā)敗血癥，導(dǎo)致小鼠的迅速死亡。死亡原因除了原發(fā)性敗血癥，還有短時間內(nèi)造成的多臟器損傷和功能衰竭。 四、一定數(shù)量的創(chuàng)傷弧菌經(jīng)口攝入而感染機體后不引起明顯消化道癥狀也沒有入血繁殖引發(fā)敗血癥。原因：胃酸的作用阻止了創(chuàng)傷弧菌進入下消化道，并且胃酸本身可殺滅該菌；創(chuàng)傷弧菌1.1758屬消化道感染弱毒力株。 五、創(chuàng)傷弧菌1.1758標準株對小鼠胃組織致病力弱，

17、其致病濃度范圍為108cfu/L～109cfu/L。 六、在海水環(huán)境中創(chuàng)傷弧菌經(jīng)由皮膚傷口侵入后，其傷口往往表現(xiàn)為感染早、發(fā)展快且病變嚴重的特點。感染組織病理學(xué)特點為組織大片的溶解壞死和大量中性粒細胞浸潤并伴有膿腔形成；傷口組織中細菌感染為混合感染，應(yīng)用抗生素治療時應(yīng)充分考慮這一點；傷口組織約8h達感染臨界，并且創(chuàng)傷弧菌在局部達一定數(shù)量后能被吸收入血引起敗血癥，因此在海水環(huán)境中感染創(chuàng)傷弧菌的傷口更應(yīng)強調(diào)早期處理，在接觸創(chuàng)傷弧菌后