植物病原細菌學實驗

1、植物病原細菌學實驗,實驗一　植物病原細菌常用培養(yǎng)基 的制作與滅菌,1.了解細菌培養(yǎng)基的種類； 2.掌握常用細菌培養(yǎng)基的配方和制作方法； 3.掌握培養(yǎng)基的滅菌方法。,一、實驗目的,二、實驗內容和操作方法,（1）配方：牛肉膏3ｇ，蛋白胨 10ｇ，NaCl 5ｇ，瓊脂 20ｇ，蒸餾水 1000 ｍL。,1.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)：分離和培養(yǎng)最常用,（2）配制過程：將牛肉膏、蛋白胨、 NaCl 溶于蒸餾水后，調節(jié)pH7.2，

2、加入瓊脂溶化后分裝于三角瓶和試管。,（一）培養(yǎng)基的配制,2. Hugh和Leifson（HL）培養(yǎng)基：細菌的好氧性和厭氧性測定蛋白胨 2.0 g 氯化鈉 5.0 g 磷酸氫二鉀 0.2 g 瓊脂 3.0 g 蒸餾水 1000.0 ml pH 7.4~7.8溴百里酚蘭（1.6％酒精溶液 1.5 ml）待培養(yǎng)基融化，并調pH后，裝于試管中，每支試管裝9 ml 滅菌。培養(yǎng)基凝固后，用接種針蘸細菌懸浮液針

3、刺接種，一直刺到管底。分別在培養(yǎng)2、4和7 d后觀察記錄。 好氧性細菌，只在開管的上部生長；兼性厭氧性細菌，則在開管的上下部都能生長；厭氧性細菌，則只能在開管的下部和閉管中生長。,（1）配方：NH4H2PO41.0ｇ，氯化鉀0.2ｇ，MgSO4.7H2O 0.2ｇ，蒸餾水1000 ｍL，溴百里酚蘭（1.6%酒精溶液）1.5 mL; 1%碳素化合物。,3.Ayers培養(yǎng)基：碳素化合物產酸試驗,單糖（葡萄糖、半乳糖）；雙糖（麥芽糖

4、、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。 有的細菌不產酸和氣，有的只產酸不產氣，少數(shù)植物病原細菌既產酸又產氣,（3）分裝：將上述培養(yǎng)基分裝于試管中，每管10 mL左右。如果測定氣體產生，加上杜氏發(fā)酵小玻管后滅菌。產酸時培養(yǎng)液變黃，產堿時變藍，產氣則小玻管內培養(yǎng)液被部分排出，出現(xiàn)空隙。,（2）配制過程：將NH4H2PO4、氯化鉀、MgSO4.7H2O溶于蒸餾水，調節(jié)pH7.0后加入溴百里酚蘭，最后加入碳素化合物（也可分別滅菌后加入

5、）,4. MR和VP試驗：對葡萄糖的分解能力,（1）配方：蛋白胨5ｇ，葡萄糖5ｇ，磷酸氫二鉀5ｇ，蒸餾水 1000 ｍL。,（2）配制過程：將蛋白胨、葡萄糖、磷酸氫二鉀溶于蒸餾水，調節(jié) pH7.0-7.2，每管分裝5mL即可。,5. 硝酸鹽還原,（1）配方：硝酸鉀1.0ｇ，蛋白胨5.0ｇ，酵母膏3.0ｇ，蒸餾水1000ｍL， pH7.0-7.2,（2）配制過程：將硝酸鉀、蛋白胨、酵母膏稱好后，溶解于蒸餾水后，調節(jié) pH。,6. 半胱氨酸

6、培養(yǎng)液：測定產H2S能力,（1）配方：蛋白胨10ｇ，硫酸鈉0.1g，半胱氨酸0.1g，蒸餾水1000ｍL。,（2）配制過程：將半胱氨酸、蛋白胨、硫酸鈉稱好后，溶解于水中，調節(jié) pH7.0-7.3即可。,7. 吲哚試驗,（1）配方： 蛋白胨20.0ｇ，磷酸氫二鈉2.0g，葡萄糖10.0g，蒸餾水1000ｍL。,（2）配制過程：將蛋白胨等稱好后，溶解于蒸餾水，調節(jié)pH7.0-7.2即可。,8. 明膠液化,（1）配方： 牛肉浸膏3.0g，蛋白

7、胨5.0ｇ，明膠10-12%，蒸餾水1000ｍL。,（2）配制過程：將牛肉浸膏、蛋白胨溶解于蒸餾水中，調節(jié)pH7.0-7.2后，將明膠溶解于此溶液中，即可分裝于試管中。,9. 淀粉水解試驗,（1）配方： 牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨17.5ｇ，淀粉1.5 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1000 ｍL。,（2）配制過程：將牛肉浸膏、蛋白胨、淀粉稱好后，溶解于蒸餾水中，加入稱好的瓊脂，待融化后調節(jié)pH7.0-7.2。,10. 石蕊牛乳反應

8、,（1）配方： 脫脂牛乳1000 ｍL ， 石蕊液（4%）15-20 mL。,（2）配制過程：提前配制石蕊液,（二）培養(yǎng)基的滅菌,上述培養(yǎng)基應按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時進行滅菌。普通培養(yǎng)基為121℃20~30min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。,明膠培養(yǎng)基

9、滅菌12-15分鐘。石蕊牛乳培養(yǎng)基間歇滅菌3次，每次通蒸汽20-30 分鐘。,滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學滅菌法兩大類。本實驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。,加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內蛋白質凝固變性，從而達到殺菌目的。高壓蒸汽滅菌法 高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。,當蒸汽壓力達到1.05

10、kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經20～30min，可全部殺死鍋內物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌。 操作方法和注意事項如下: 加水 打開滅菌鍋蓋，向鍋內加水到水位線。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。,裝料、加蓋 滅菌材料放好后，關閉滅菌器蓋，采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。 排氣 打開放氣閥。用電

11、爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當有大量蒸汽排出時，維持5min，使鍋內冷空氣完全排凈。,升壓、保壓和降壓 當鍋內冷空氣排凈時，即可關閉排氣閥，壓力開始上升。當壓力上升至所需壓力時，控制電壓以維持恒溫，并開始計算滅菌時間，待時間達到要求（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121℃，20min）后，停止加熱，待壓力降至接近“0”時，打開放氣閥。 注意不能過早過急地排氣，否則會由于瓶內壓力下降的速度比鍋內慢而造成瓶

12、內液體沖出容器之外。,干熱滅菌法 通過使用干熱空氣殺滅微生物的方法叫干熱滅菌。一般是把待滅菌的物品包裝就緒后，放入電烘箱中烘烤，即加熱至160～170℃維持1～2h。 干熱滅菌法常用于空玻璃器皿、金屬器具的滅菌。凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養(yǎng)基等都不能用此法滅菌。,1 細菌（NA）和真菌(PDA)常用培養(yǎng)基的配方和制 作過程有何異同點？2 試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和注意事項。,三、作業(yè),實驗二 植物病原細菌的分離

13、 和致病性測定,二、實驗內容和操作方法,（1）首先要選擇典型、新鮮病組織;（2）以滅菌剪將病斑剪下，略帶健康組織，大小約0.5～1公分左右，放在滅菌載玻片中央，加無菌水1d。加上滅菌蓋玻片，靜置約10min左右，觀察是否有云霧狀自破口處涌出,（一）細菌溢現(xiàn)象觀察,（1）斑點型：如棉花角斑病。A. 剪取新鮮的典型病斑，約1cm見方。,（二）植物病原細菌的分離,1. 細菌懸浮液的配制（不同癥狀類型分離材料的選擇和

14、表面消毒）,B.表面消毒：將切取的組織塊在70％乙醇中浸一下立即取出，然后用表面消毒劑進行表面消毒，可以采用0.1％升汞，15″－2min或0.5％的次亞氯酸鹽如漂白粉（1：9稀釋液）2min　C.消毒后用滅菌水洗滌3次，將病組織放在另一個培養(yǎng)皿的滅菌水中，剪破中心或以滅菌玻璃棒研碎病組織靜置20－30分鐘，等細菌游出。,（2）萎蔫型如茄青枯病　將莖部剪成1－2寸長，表面用70％酒精輕拭，在火焰上表面消毒，以滅菌刀縱剖，選擇輕微變色

15、病部，以滅菌刀切出薄片或以解剖針挑出病健交界處組織（可以不再消毒），加滅菌水浸泡20-30分鐘?！∪绻o部較粗，也可以在表面消毒后用解剖刀橫斷莖部，用夾子或手緊壓莖部橫斷面，擠出溢膿或汁液。,（3）腫瘤組織,軟瘤比較容易分離；木質瘤可以磨碎后接種在向日葵、番茄等幼株上長出瘤后再分離。　　由于細菌位于表皮細胞和木質部之間，因此應用酒精棉花擦拭表面，在火焰上表面消毒，再在滅菌皿中實行解剖后以滅菌玻棒將其搗碎，靜置浸泡24h。,（4）腐爛

16、組織,較簡單，選擇近病部交界處以接種環(huán)挑取少量腐爛組織，稀釋。,（5）種子帶菌的分離,選擇病種子，以0.1％升汞液表面消毒1－2min，滅菌水洗滌，再將此種子在70％酒精中浸幾分鐘，洗滌2－3次，取出放在研缽中磨碎，離心取上清液。,2. 分離方法,A.倒平板：注意培養(yǎng)基的溫度不能太高，否則冷凝水太多，細菌在水中游動而影響單個分散菌落的形成。,（1）平板劃線分離法：被普遍采用,B.用接種環(huán)蘸取上述配制好的菌懸液，在已凝固的平板培養(yǎng)基表面劃

17、線,（2）培養(yǎng)皿稀釋分離法,3.培養(yǎng),一般放置在 28－30℃溫箱中倒置培養(yǎng)，時間2～3 d。,將冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基倒入裝有稀釋菌液的培養(yǎng)皿中，輕輕轉動培養(yǎng)皿，使菌液和培養(yǎng)基混勻，待其凝固后培養(yǎng)。,4.細菌的純化,挑取分離出的典型單菌落平板劃線培養(yǎng)（2皿），如此重復1－2次，最后，在均勻一致的平板中，挑取典型菌落移植在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長成后在4℃環(huán)境中保存菌種。,1. 配制107-108CFU/mL的細菌懸浮液，菌齡48小時左右

18、；,（二）致病性測定,2. 指示植物的選擇：一般用煙草，在假單胞和黃單胞菌屬上較適用。,3. 接種方法：用注射器將細菌液從煙草下表皮注入葉肉細胞間。用滅菌水作陰性對照，同屬HR陽性的菌株作陽性對照。,4. 培養(yǎng)條件：接種后的植物應保持在25℃，相對濕度較高（85%）的條件下。,5. 結果觀察：在24～48h表現(xiàn)枯斑為陽性反應，3d左右出現(xiàn)黃斑為陰性反應。,三 作業(yè)：1.簡述本實驗中植物病原細菌的分離步驟及其操作注意事項2. 煙草過敏

19、性反應試驗能夠確定細菌的致病性嗎？為什么？,,實驗三　植物病原細菌的形態(tài)觀察,1.了解革蘭氏染色鑒定的快速鑒定方法；　2.掌握革蘭氏染色和鞭毛染色的方法；　3.掌握細菌培養(yǎng)性狀的描述特征。,一、實驗目的,二、實驗內容和操作方法,1.結晶紫草酸銨染色,（一）革蘭氏染色,（1）試劑,A. 結晶紫草酸銨染劑：,溶液Ⅰ：結晶紫2.0g，酒精（95%）20mL,混合溶液Ⅰ和Ⅱ，過濾，貯藏于試劑瓶中，24h后使用。,溶液Ⅱ：草酸銨0.8g，蒸

20、餾水80mL,C.復染劑,原液：番紅O 2.5g，95%酒精100mL,復染劑：原液10mL，蒸餾水90mL,B. 魯戈爾碘液：碘1.0g，碘化鉀2g蒸餾水300mL。,將碘和碘化鉀在研缽中研和，慢慢加水并繼續(xù)研和直至碘和碘化鉀溶解，然后加水稀釋到300mL，盛入棕色試劑瓶，放暗處備用。,（2）染色程序,A. 配制細菌懸浮液：菌齡16h,B. 在干凈的載玻片上涂片、風干，不要加熱，然后在火焰上通過2次，固定玻片。,C. 結晶紫染色1分

21、鐘，水洗數(shù)秒鐘，吸干。,D. 碘液處理1分鐘，水洗，吸干。,E. 用95%酒精褪色約30秒。水洗，吸干,F. 番紅O復染10秒，水洗，吸干,G. 加1滴香柏油，在油鏡下鏡檢，紅色為革蘭氏陰性菌，紫色為革蘭氏陽性菌。,2.　氫氧化鉀溶解試驗,（1）試劑：3％氫氧化鉀,（2）方法：取1－2滴3％氫氧化鉀溶液置于干凈的　玻片上，用牙簽取新鮮細菌培養(yǎng)物與氫氧化鉀混合，充分攪拌10－20秒，如果液滴變粘稠并可拉出絲狀物體，表示測試菌為革蘭氏陰性菌

22、，反之則為革蘭氏陽性菌。,1.試劑,（二）鞭毛染色（西薩－基爾法）,（1）媒染劑：單寧酸10g，ALCL3.6H2O 18g，ZnCL2 10g，堿性品紅1.5g，60%酒精40mL,在研缽中加入酒精和上述各種成分，充分研磨后，再加入其余的酒精。使用前用蒸餾水稀釋2倍，染色時過濾，濾液直接滴在涂片上。,溶液Ⅰ：堿性品紅0.3g，酒精（95%）10mL,溶液Ⅰ和Ⅱ分別配制后混合。,溶液Ⅱ：苯酚（結晶）5g，蒸餾水95mL,（2）染液：,

23、2. 染色步驟,（1）載玻片準備：選用新的或沒有傷痕的，先用洗潔精浸泡洗滌，用清水洗凈后，再放入酸酒精（硫酸與酒精等量混合）中浸泡24-48h，取出后用清水洗凈，再用蒸餾水洗，瀝干水后，浸泡在95%酒精中備用。,（2）配制細菌懸浮液，菌齡很重要，一般適溫培養(yǎng)16-24h。用吸管沿試管壁緩緩加入無菌水5mL，，靜置30分鐘左右，配成菌懸液。,（3）涂片：取浸在酒精中的載玻片，在火焰上燒去酒精，平放，用吸管吸取細菌懸浮液（以上層為好）在載玻

24、片的一端滴一滴，然后將載玻片稍稍傾斜，使菌懸液從一端緩緩流向另一端，使涂片自然風干。,（4）媒染劑過濾后，直接將濾液滴在涂片上，處理5-7分鐘,（5）用水輕輕洗去染媒劑，甩去載玻片上剩余的水，在空氣中干燥后，再加苯酚品紅染劑染色5分鐘。,（6）水洗，在空氣中干燥后，加1滴香柏油，在油鏡下觀察鞭毛的數(shù)量和著生位置。,1.革蘭氏染色反應和鞭毛染色在植物病原細菌鑒定中有何作用？為什么？2.細菌鞭毛染色對菌齡的要求比較嚴格，在操作過程中也要注

25、意動作的輕柔，為什么？3 觀察和記錄NA平板上的細菌菌落性狀、菌體形狀、運動性和革蘭氏染色結果。,三 作業(yè),實驗四 植物病原細菌生理生化測定,1. 掌握無菌操作技術；2. 了解各種生理生化性狀測定常用試劑的配制方法；3. 掌握各種生理生化性狀的觀察方法。,一、實驗目的,二、實驗內容和方法,1.產酸和產氣試驗,（一）碳素化合物的利用,1）接菌培養(yǎng)：一般每5 mL培養(yǎng)液接種0.1mL 108 CFU/ml菌懸液，適溫下培養(yǎng)3-4周

26、。,2）結果觀察：,（1）配方：NH4H2PO41.0ｇ，氯化鉀0.2ｇ，MgSO4.7H2O 0.2ｇ，蒸餾水1000 ｍL，溴百里酚蘭（1.6%酒精溶液）1.5 mL; 1%碳素化合物。,Ayers培養(yǎng)基：碳素化合物產酸試驗,單糖（葡萄糖、半乳糖）；雙糖（麥芽糖、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。 有的細菌不產酸和氣，有的只產酸不產氣，少數(shù)植物病原細菌既產酸又產氣,（3）分裝：將上述培養(yǎng)基分裝于試管中，每管10 mL左右

27、。測定氣體產生時，加上杜氏發(fā)酵小玻管后滅菌。,（2）配制過程：將NH4H2PO4、氯化鉀、MgSO4.7H2O溶于蒸餾水，調節(jié)pH7.0后加入溴百里酚蘭，最后加入碳素化合物（也可分別滅菌后加入）,3）MR試驗結果觀察：取上述培養(yǎng)液5ml，加甲基紅試劑2~3滴，呈明顯紅色為陽性，呈黃色為陰性。,2.甲基紅(MR)和VP(產3-羥基丁酮)試驗,1）接菌培養(yǎng)：一般每5mL培養(yǎng)液接種0.1mL108CFU菌懸液，適溫下培養(yǎng)1周。,2）甲基紅試劑

28、配制：甲基紅0.1g溶解于300ml的95%酒精中，然后用蒸餾水稀釋至500ml。,4）VP試驗結果觀察：每毫升加0.1mL40%KOH溶液, 置48-50℃水浴處理2h，充分搖動后觀察結果。在4h內出現(xiàn)紅色者為陽性反應。,測定亞硝酸，每試管加試劑A和試劑B各1ml如呈紅色，表示有亞硝酸根。,1）接菌：在培養(yǎng)液中接菌后培養(yǎng)1周,（二）氮素化合物的分解,2）Griess-Llosvary試劑測定法,試劑A：對氨基苯磺酸8.0g，5mol/

29、L醋酸（286.0ml冰醋酸加715.0ml水）1000ml,試劑B：二甲基-α-萘胺6ml，5mol/L醋酸1000ml,1.硝酸鹽還原,1）醋酸鉛濾紙條的制備：將濾紙剪成5mm×50mm的小條浸在5%醋酸鉛溶液中，空氣中干燥后，在120℃烘箱中滅菌1h。,2）接菌：將細菌接種于試管中的培養(yǎng)液中后，用上述制備的濾紙條夾在棉花塞和試管壁之間，使紙條懸在培養(yǎng)液面上，但不要碰到培養(yǎng)液，25℃培養(yǎng)2周。,3）結果觀察：紙條變黑表示有

30、硫化氫產生，為陽性反應。,2.硫化氫產生,1）草酸濾紙條的制備：將濾紙剪成5mm×50mm的小條浸在飽和草酸溶液中，空氣中干燥后，在120℃烘箱中滅菌1h。,2）接菌：將細菌接種于試管中的培養(yǎng)液中后，用上述制備的濾紙條夾在棉花塞和試管壁之間，使紙條懸在培養(yǎng)液面上，但不要碰到培養(yǎng)液，適溫培養(yǎng)1周。,3）結果觀察：紙條變淡紅色表示有吲哚產生，為陽性反應。,3.吲哚產生,1）接菌：采用穿刺法接菌后，放在適溫中培養(yǎng)1-3周。以不接菌試

31、管為對照。,（三）大分子化合物的利用,2）結果觀察：將經過培養(yǎng)的接菌試管取出后，放在4℃冰箱中，看其是否凝固，如不凝固，則說明明膠分解而導致液化，為陽性反應。,1.明膠液化,A.酸的產生：石蕊牛乳變成粉紅色，表示從乳糖產酸,1）接菌：將培養(yǎng)基接種細菌于28℃培養(yǎng)1-3周，以不接種的石蕊牛乳做對照。,2）結果觀察：,2.石蕊牛乳反應,B.凝固：產酸達到pH4.7發(fā)生凝塊，如產氣凝塊斷裂； 凝乳酶的作用而凝固，凝塊收縮與乳清分

32、離。,C.胨化：牛乳變清，往往從表層開始,D.堿的產生：石蕊牛乳變藍色，胨化時常呈堿性,E.石蕊還原：石蕊變?yōu)闊o色,在平板上加碘液后，培養(yǎng)基為深蘭色，菌落周圍有無色透明圈者為陽性。,1）接菌：將細菌接種于淀粉瓊脂平板上，適溫下培養(yǎng)24-48小時。,2）結果觀察：,3. 淀粉水解試驗,四、細菌的好氧性和厭氧性測定蛋白胨 2.0 g 氯化鈉 5.0 g 磷酸氫二鉀 0.2 g 瓊脂 3.0 g 蒸餾水 100

33、0.0 ml pH 7.4~7.8溴百里酚蘭（1.6％酒精溶液 1.5 ml）待培養(yǎng)基融化，并調pH后，裝于試管中，每支試管裝9 ml 滅菌。培養(yǎng)基凝固后，用接種針蘸細菌懸浮液針刺接種，一直刺到管底。分別在培養(yǎng)2、4和7 d后觀察記錄。 好氧性細菌，只在開管的上部生長；兼性厭氧性細菌，則在開管的上下部都能生長；厭氧性細菌，則只能在開管的下部和閉管中生長。,1）試劑：1%二甲基對苯二胺鹽酸鹽或1%四甲基對苯二胺鹽酸鹽。,（

34、五）其他生理生化試驗,2）測定方法：,1.氧化酶試驗,A. Kovacs：在培養(yǎng)皿內放一張濾紙，濾紙上加3-4滴試劑使其濕潤，用牙簽挑取24h菌苔涂在濾紙上，60秒內變成紫色為陽性反應，60秒后或不便色為陰性。,B.濾紙條法：用濾紙條蘸少許菌苔，加1d試劑，立即呈粉紅色為陽性,1）試劑：3%過氧化氫,2）測定方法：挑取固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-48h的菌苔，置于干凈玻片上，滴加過氧化氫。,2.過氧化氫酶（接觸酶）試驗,3）結果觀察：在半分鐘

35、內有大量氣泡產生的為陽性，不產生氣泡的為陰性。,三 作業(yè)：,1 若有吲哚和硫化氫產生，其實驗的試管口上的濾紙條會發(fā)生什么樣的顏色變化，為什么？2 在石蕊牛乳不能和其他細菌培養(yǎng)基一起滅菌，為什么？反應中會出現(xiàn)多種不同的反應，試分析其發(fā)生的原因？ 3 觀察和記錄細菌氧化發(fā)酵試驗、MR試驗以及接觸酶試驗結果。,實驗五 植物病原細菌的PCR分子鑒定,1 了解PCR反應的原理；掌握PCR反應的操作方法。,一、實驗目的,二、PCR擴增

36、 聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）,1、PCR技術的基本原理　類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與目標序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈（以便它與引物結合，為下輪反應作準備）；②模板DNA與引物的退火(復性

37、)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；,③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴

38、增放大幾百萬倍。,,2 The procedure of PCR,d.NTPs,Taq,Primers,component,denaturation,,(94℃),,,extension,,repeated,anneal,,,,,(72℃),(50℃),,,,5’,3’,5’,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,3’,5’,,,3’,,,,,,,,,

39、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,5’,3’,5’,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,3’,,5’,3’,5’,,,3’,2 cycles4 copies,3 cycles8 copies,,,,5’,,5’,3’,,5’,3’,5’,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

40、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,3’,,5’,3’,5’,,,3’,,5’,3’,5’,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,3’,,5’,3’,5’,,,3’,,3’,5’,,5’,3’,5’,,,3’,,5’,3’,5’,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

41、,,,,,,,,,3’,,,,,,,,,,,,,3 反應體系 取一0.5 ml PCR薄壁管，依次加入以下試劑：,,,,,,,,,,,,,M 1 2 3 4,,,3kb,2kb,0.8% agrose gel electrophoresis of full length PCR product from Y160M:

42、 DNA marker; 1: Y160; 2:positive control; 3 4: CK-,,2.7kb,引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會?！　∶讣捌錆舛龋骸∧壳坝袃煞NTaq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約

43、需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。,4 PCR反應操作注意事項：,dNTP的質量與濃度　 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節(jié)到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降

44、解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。,模板(靶基因)核酸　模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一。Mg2+濃度　Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃

45、度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。,,PCR反應條件的選擇　　PCR反應條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。,①變性溫度與時間： 變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lm

46、in足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。,②退火(復性)溫度與時間：重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。③延伸溫度與時

47、間：　PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。,PCR延伸反應的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。循環(huán)次數(shù)　　 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取

48、決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產物的量亦隨之增多。,5 PCR污染與對策 PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污 染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生.1）污染原因　標本間交叉污染　PCR試劑的污染　PCR擴增產物污染.　實驗室中克隆質粒的污染,2）污染的監(jiān)測對照試驗陽性對照陰性對照重復性試驗選擇不同區(qū)域的引物

49、進行PCR擴增,,3）防止污染的方法合理分隔實驗室樣槍預混和分裝PCR試劑防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用.設立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ諟p少PCR循環(huán)次數(shù)選擇質量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前 應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部.開管動作要輕，以防管內液體濺出.,1、PCR反應：A. 取0.5ml 的eppendorf 管中依次加入效率試劑（共

50、50?l）: 35?l H20 5?l 10X PCR反應緩沖液 4?l 25 mmol/L MgCl2 4?l 4種 dNTP 0.5?l 上游引物（引物1） 0.5?l 下游引物（引物2）

51、0.5?l 模板DNA(約1ng) 0.5ul Taq DNA聚合酶（約2.5單位） 混勻后離心5秒鐘,二、實驗內容和操作方法,B．混合物在94℃下加熱5min 。C．94 ℃變性30秒種，62℃退火1分鐘，72℃延伸2分 鐘，循環(huán)30輪，進行PCR。最后一輪循環(huán)結束后，于 72℃下保溫10分鐘，使反應產物擴增充分。2、電泳：