致死性EV71感染的病理學及分子病毒學研究.pdf

1、手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是由腸道病毒感染引起的一種嚴重的傳染病,并呈現(xiàn)逐年高發(fā)態(tài)勢。近年發(fā)現(xiàn)HFMD主要病原體為腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71),兒童為EV71易感人群。兒童感染EV71后臨床表現(xiàn)形式多樣,除典型的HFMD外,還常表現(xiàn)出嚴重的中樞神經疾病及肺水腫和/或肺淤血等并發(fā)癥,嚴重的甚至導致死亡。目前對于EV71感染引發(fā)HFMD的發(fā)生發(fā)展過程尚不清楚,且缺乏

2、有效的預防及治療方法,常導致臨床醫(yī)療嚴重后果的發(fā)生,因此明確HFMD病原,全面分析EV71感染后病理改變,探討發(fā)病機理,以及研發(fā)安全、有效的HFMD疫苗成為預防和控制HFMD疾病暴發(fā)的有效手段之一。據(jù)此,本論文從一例疑似HFMD的死亡案例出發(fā),從法醫(yī)病理學、分子病毒學、動物實驗等幾個方面對該病例及其致病病原EV71進行了深入的研究,具體內容有以下五個章節(jié)。
　　第一章以文獻綜述的形式介紹了HFMD及EV71的研究背景,主要包括HF

3、MD的流行情況,其主要病原體EV71的病毒學特點,流行病學研究,致病機理研究,EV71感染的臨床診斷和治療,疫苗的研究現(xiàn)狀,實驗動物的選擇以及桿狀病毒表達系統(tǒng)的原理、技術路線及其作為基因工程疫苗載體的研究進展等。最后說明了本論文研究的內容及意義。
　　第二章利用常規(guī)法醫(yī)病理學分析方法,對一例疑似HFMD致死案例進行了分析,發(fā)現(xiàn)CNS病變明顯,神經細胞壞死、膠質小結形成、炎細胞呈袖套樣浸潤,肺水腫顯著、炎癥突出,確認死因為病毒性腦炎

4、及病毒性肺炎導致的急性呼吸、循環(huán)功能衰竭。在此基礎上利用RT-PCR技術,以國家CDC指導的EV71通用檢測引物,證實病原體為EV71。隨后針對EV71保守區(qū)設計特異性引物進行巢式PCR擴增,檢測了各病理組織的病毒載量;利用抗EV71 VP1蛋白的特異性多克隆抗體對石蠟切片進行免疫組織化學染色檢測了病毒抗原的組織分布。結果顯示此病例腦組織EV71病毒載量相對較高,其中腦干和頸髓最高;病毒抗原檢測陽性主要集中在CNS的神經細胞及炎細胞,為

5、病毒感染復制的主要部位;肺組織雖病變明顯,水腫/淤血突出,但病毒核酸及抗原陰性,并非病毒主要感染復制部位;
　　第三章自病毒載量最高的腦干組織出發(fā),在體外 RD細胞上進行病毒的分離、傳代及空斑純化,通過一步法生長曲線的方法了解不同株純化病毒的感染性差異,同時利用EV71-VP1基因的序列對病毒株進行基因分型。篩選出一株純化病毒,擴增出核酸序列進行分段克隆,獲得EV71病毒的全基因組,并提交GenBank。結果顯示:腦干組織能成功分

6、離到EV71-xf活病毒,在 RD細胞上能產生腸道病毒特異性致細胞病變效應(Cytopathic effect,CPE),透射電鏡能觀察到大小均勻、形態(tài)一致、直徑約20-30nm的EV71病毒粒子。經空斑純化后的四株病毒在體外RD細胞上感染性基本無差別,VP1測序結果顯示均為C4亞型;完成了一株病毒的全基因組測序,基因組全長為7405bp,GenBank登錄號(Accession number)為JQ804832,基因組序列提示此次感染

7、病毒仍為國內流行株C4亞型,全基因組序列的測定將有利于后續(xù)的深入研究。
　　第四章對純化的EV71-xf病毒進行了建立小動物感染模型的初步摸索。通過顱腔注射(Intracranial injection,IC)的途徑使1日齡Balb/c小鼠感染EV71-xf病毒,觀察其表現(xiàn),隔周采血對血清特異性抗體IgG及中和抗體進行檢測,同時分離鼠腦組織中病毒再次接種1日齡小鼠,獲得鼠適性毒株。結果發(fā)現(xiàn)1日齡Balb/c小鼠能通過IC途徑感染E

8、V71-xf,但無明顯的神經系統(tǒng)受累表現(xiàn);血清抗體IgG在感染兩周后較高,但仍處于亞中和抗體水平;IC二次感染可以刺激小鼠產生更高濃度IgG,并在RD細胞上表現(xiàn)出較好的特異性及交叉性中和保護作用;母傳抗體的中和保護作用較強,但時間短暫,約4w齡時其保護作用消失;反復多次鼠腦適應,可以得到感染性增強的鼠適株EV71-xf/A/J/Q,但其毒力情況還需進一步研究。
　　第五章利用桿狀病毒表達系統(tǒng)開展了EV71基因工程疫苗的初步研究。將

9、編碼EV71-xf的P1和3CD蛋白的基因分別克隆至pFastBac-Dual載體的啟動子pPh和pP10下游的多克隆位點,構建重組pFastBac Dual-EV71-xf-3CD-P1質粒。重組質粒與桿狀病毒Bacmid轉座后獲得重組Bacmid Bac-EV71-xf-3CD-P1。提取重組Bacmid DNA轉染昆蟲Sf9細胞,獲得重組病毒,重組病毒感染昆蟲細胞后,表達的前體蛋白P1在蛋白水解酶3CD的剪切后自組裝為病毒樣顆粒(

10、Virus Like Particle,VLPs),經蔗糖及氯化銫密度梯度離心進行初步的純化,Western Blot檢測目的蛋白表達與剪切,透射電鏡觀察VLPs顆粒;另外還構建了新的穩(wěn)定表達3CD的細胞系Sf9-3CD,用于VLPs的構建策略。結果顯示,重組桿狀病毒AcBac-EV71-xf-3CD-P1在Sf9細胞內能同時表達前體蛋白P1和蛋白水解酶3CD,3CD能正確剪切P1蛋白成為VP1等結構蛋白,并自組裝為VLPs,經蔗糖及氯

11、化銫密度梯度離心等初步純化后,Western Blot顯示VLPs具有VP1的抗原表位,透射電鏡觀察VLPs的形態(tài)、大小及構象均類似于天然的EV71病毒粒子,可以作為EV71疫苗的候選物。Sf9-3CD細胞系能穩(wěn)定表達3CD蛋白并剪切P1,形成VLPs,可以作為構建VLPs的新途徑。
　　綜合以上研究內容,本研究完成了一例疑似HFMD案例的法醫(yī)病理學分析,確定了其致病病原為腸道病毒EV71,并從病理組織中分離、純化到一株高活性的E