ALV-J致病機(jī)制的體外分子病理學(xué)研究.pdf

1、ALV-J主要引起雞的骨髓細(xì)胞瘤(Myelocytoma)或骨髓白血病(Myeloid Leukosis，ML)和多種細(xì)胞類型的惡性腫瘤。近年來我國蛋雞群出現(xiàn)ALV-J感染病例的報(bào)道不斷增加，在我國J亞群白血病已由最初只有肉用雞感染發(fā)病，逐漸向商品蛋雞和中國許多地方品種雞蔓延，其宿主范圍正在擴(kuò)大，腫瘤表型也在不斷變化。
　　本研究選擇早期分離自肉雞髓樣細(xì)胞瘤病例的NX0101株和近期分離自蛋雞血管瘤病例的HN10PY01株J亞群禽

2、白血病病毒，分別接種DF-1細(xì)胞、SPF蛋雞CEF細(xì)胞及白羽肉雞父母代CEF細(xì)胞，在感染后1、2、3、5、7天分別收集細(xì)胞和細(xì)胞上清。檢測(cè)細(xì)胞上清ALV群特異性抗原p27的表達(dá)量、病毒TCID50，比較研究?jī)啥局陮?duì)不同來源的CEF細(xì)胞的易感性及在不同細(xì)胞上的復(fù)制能力;收集細(xì)胞用熒光定量法檢測(cè)感染細(xì)胞的原癌基因(c-myc、c-myb)、抑癌基因(p53、p27、p16)和凋亡基因(Bcl-2)以及細(xì)胞熱應(yīng)激蛋白HSP70和HSP60基因

3、的mRNA表達(dá)量;并用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清中熱應(yīng)激蛋白HSP70和HSP60的表達(dá)量;通過凋亡試劑盒檢測(cè)感染細(xì)胞的凋亡狀況，比較研究不同來源的ALV-J毒株感染不同靶細(xì)胞后的分子病理學(xué)變化，探討ALV-J宿主范圍擴(kuò)大、組織嗜性及致瘤表型改變的分子病理學(xué)機(jī)制。
　　結(jié)果表明:細(xì)胞上清ALV群特異性抗原p27表達(dá)量和病毒TCID50在兩毒株和不同細(xì)胞之間均有差異，兩毒株接種DF-1細(xì)胞后p27產(chǎn)生的速度最快，含量最高，與另外兩種

4、CEF細(xì)胞相比，兩毒株對(duì)DF-1細(xì)胞具有更強(qiáng)的易感性;HN10PY01株感染三種細(xì)胞后p27表達(dá)量和TCID50變化速率高于NX0101株，且其最高值也高于NX0101株，表明HN10PY01株復(fù)制能力要強(qiáng)于NX0101株;由p27表達(dá)量和TCID50變化速率可以看出HN10PY01株對(duì)蛋雞源CEF細(xì)胞更為易感，而NX0101株則對(duì)肉雞源CEF細(xì)胞的易感性更高。熒光定量檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因結(jié)果表明，三種類型的細(xì)胞被病毒感染后原癌基因c-my

5、c、c-myb的表達(dá)量均呈極顯著性升高，原癌基因的高表達(dá)，可能是ALV-J最重要的分子致病機(jī)制，HN10PY01株出現(xiàn)高表達(dá)的時(shí)間更早，表明其具有更強(qiáng)的致病能力。病毒感染細(xì)胞抑癌基因p53的表達(dá)呈顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)升高，在此高表達(dá)的p53是否為突變型有待于試驗(yàn)驗(yàn)證;抑癌基因p16、p27表達(dá)多為上調(diào)，與相關(guān)報(bào)道不符，其機(jī)理也有待進(jìn)一步研究。感染細(xì)胞凋亡基因Bcl-2的表達(dá)均表現(xiàn)為極顯著升高，且而兩毒株間基本一致

6、，Bcl-2基因的高表達(dá)可能是ALV-J又一重要致病機(jī)制。兩毒株感染細(xì)胞上清的HSP70蛋白表達(dá)量多呈極顯著上調(diào)，另外，HN10PY01株感染細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)量明顯高于NX0101株，這可能與細(xì)胞感染病毒后發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，并且這種應(yīng)激反應(yīng)在兩毒株間有所不同，HN10PY01株的感染對(duì)細(xì)胞帶來了更大的應(yīng)激反應(yīng)。NX0101株感染肉雞CEF細(xì)胞后HSP70的表達(dá)量顯著下降，此變化是否與該毒株對(duì)肉雞CEF細(xì)胞的易感性高，對(duì)其應(yīng)激反應(yīng)

7、能力的嚴(yán)重破壞有關(guān)，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。HSP70蛋白與種瘤的發(fā)生有著復(fù)雜的關(guān)系，有研究表明HSP70蛋白表達(dá)量的升高具有阻止細(xì)胞腫瘤性轉(zhuǎn)化的作用。兩毒株感染不同細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞上清HSP60蛋白多呈差異顯著性降低，兩毒株在CEF細(xì)胞上的表達(dá)量HN10PY01組高于NX0101組，表明感染細(xì)胞對(duì)兩種病毒感染的反應(yīng)有所不同;感染細(xì)胞HSP60蛋白含量降低可能會(huì)抑制感染細(xì)胞凋亡，有利于腫瘤的發(fā)生。ALV-J感染DF-1后，感染