斜紋夜蛾SL-1細(xì)胞色素C基因的克隆及其原核表達(dá).pdf

1、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的熱門(mén)領(lǐng)域，在哺乳動(dòng)物、線蟲(chóng)和果蠅中，細(xì)胞凋亡的研究非常廣泛，凋亡的分子機(jī)制也取得了較大的進(jìn)展。雖然細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制在整個(gè)生物進(jìn)化過(guò)程中是高度保守，而且哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡途徑與昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡途徑有許多相似之處，但也存在許多不同的地方，比如細(xì)胞凋亡的線粒體通路中，在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞凋亡中是由于細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與細(xì)胞質(zhì)中的Apaf-1結(jié)合，從而活化caspase，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡

2、的發(fā)生。而在果蠅和線蟲(chóng)的細(xì)胞凋亡中，細(xì)胞色素C的作用卻與哺乳動(dòng)物的不太一致。但是鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡研究顯示Cyto C的作用與哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡相似，即凋亡細(xì)胞過(guò)程中發(fā)生Cyto C的釋放等事件。由于Cyto C在線粒體信號(hào)通路中具有重要的作用，而且迄今有關(guān)鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡過(guò)程中Cyto C釋放的檢測(cè)、定位或無(wú)細(xì)胞體系研究等均是以哺乳動(dòng)物Cyto C和其抗體進(jìn)行的，由于Cyto C在鱗翅目昆蟲(chóng)和雙翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡中的作用存在差異，為揭示

3、和闡述Cyto C在鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用及其分子機(jī)制，我們擬克隆和表達(dá)斜紋夜蛾(Spodoptera litura)Cyto C，利用內(nèi)源性Cyto C系統(tǒng)為研究鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞細(xì)胞色素C介導(dǎo)線粒體信號(hào)途徑的地位與作用奠定基礎(chǔ)。
　　 本文克隆了鱗翅目昆蟲(chóng)斜紋夜蛾(Spodoptera litura)的細(xì)胞色素C基因，構(gòu)建了細(xì)胞色素C蛋白的原核表達(dá)重組質(zhì)粒(pET-28a-Cyto C)和真核表達(dá)重組質(zhì)粒(pIZT/V5

4、-His-Cyto C)，并實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞色素C基因的原核表達(dá)。
　　 首先利用細(xì)胞色素C在不同物種中保守性較高的特點(diǎn)，根據(jù)家蠶(Bombyx mori)和果蠅(Drosophila)的細(xì)胞色素C序列的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，利用Trizol法提取斜紋夜蛾(SL-1)細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，得到一條長(zhǎng)247bp的cDNA序列；然后以這條序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了幾組3'-RACE和5'-RACE特異性引物，再利用SMAR

5、T RACE技術(shù)克隆了SL-1細(xì)胞的細(xì)胞色素C的3’端和5'端序列；最后通過(guò)拼接得到一個(gè)長(zhǎng)801bp細(xì)胞色素C的cDNA序列，該cDNA包含一個(gè)327bp的開(kāi)放閱讀框，編碼108個(gè)氨基酸，在3’端有一個(gè)長(zhǎng)247bp的非編碼區(qū)(不含ployA尾)，5'端有一個(gè)長(zhǎng)172bp的非編碼區(qū)。NCBI序列比對(duì)，顯示它與果蠅(Drosophila)和家蠶(Bombyx mori)的細(xì)胞色素C序列的同源性分別為80％和82％。
　　 得到SL-

6、1細(xì)胞的細(xì)胞色素C的cDNA全長(zhǎng)序列后，根據(jù)其開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出細(xì)胞色素C的開(kāi)放閱讀框，利用NdeⅠ和HindⅢ對(duì)其進(jìn)行雙酶切，再將其連接到pET-28a載體上，構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒(pET-28a-Cyto C)；同時(shí)，利用Kpn I和Xba I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，并將其連接到pIZT/V5-His載體，構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒(pIZT/V5-His-Cyto C)。
　　 原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功后，先