干擾Cyt-c表達對AfMNPV誘導斜紋夜蛾細胞凋亡的影響.pdf

1、Cyt-c是一類水溶性蛋白,是由核基因編碼合成,依附在線粒體內膜表面。Cyt-c作為一種載體,在呼吸鏈電子傳遞過程起重要作用。一旦Cyt-c功能出現(xiàn)障礙或是Cyt-c缺失,將會致使呼吸鏈功能出現(xiàn)異常,進而引起ATP缺乏,最終使細胞出現(xiàn)死亡。此外,Cyt-c由線粒體釋放至細胞質也是線粒體介導凋亡信號轉導的最重要事件,即通過caspase等途徑誘導細胞凋亡。盡管在哺乳動物細胞凋亡研究中已經證實Cyt-c能由線粒體釋放至細胞質進而影響細胞凋亡

2、,但昆蟲細胞凋亡中是否也存在同樣的途徑并不沒完全闡明。在雙翅目昆蟲細胞凋亡研究中,關于Cyt-c的作用存在一些不同結果。到目前為止,普遍性認為Cyt-c不會從線粒體釋放至細胞質,caspase的活化與細胞凋亡也不依靠細胞Cyt-c。然而,鱗翅目昆蟲細胞凋亡的研究結果卻與雙翅目體系相反的結論。如:利用2-dexory-D-ribose誘導舞毒蛾IPLB-LdFB細胞的細胞凋亡,發(fā)現(xiàn)了Cyt-c的釋放和caspase-3的活性；紫外線誘導S

3、f9細胞凋亡,Western雜交檢測到Cyt-c由線粒體釋放至細胞質,且能激活相關的凋亡蛋白。同時,桿狀病毒P35基因的表達會抑制Cyt-c從線粒體釋放出來。
　　 本實驗室利用桿狀病毒處理鱗翅目斜紋夜蛾SL-1細胞,Cyt-c會由線粒體釋放至細胞質中,且能激活caspase-3的活化。但是這些研究主要建立在western雜交上,需要利用其他方法驗證。本實驗室已利用RNAi技術研究Cyt-c在SL-1細胞凋亡體系的作用。研究發(fā)現(xiàn)

4、,利用RNAi沉默SL-1細胞的Cyt-c表達后,再經桿狀病毒處理細胞,Cyt-c的mRNA水平降低、caspase-3的活性有所降低等。
　　 在前期的研究基礎之上,我們繼續(xù)采用RNAi技術進一步研究Cyt-c在鱗翅目昆蟲細胞凋亡中作用。利用體外轉錄的方法,合成相應的dsRNA；用雙染(AnnexinV-FITC和PI)對經RNAi處理的細胞進行細胞凋亡率的檢測；經RNAi干擾,病毒誘導凋亡細胞后,分析caspas-9的活性等

5、。
　　 從形態(tài)上,利用顯微鏡觀察經DAPI染色的細胞,我們可以發(fā)現(xiàn)RNAi沉默Cyt-c的表達,細胞凋亡數(shù)量減少,凋亡小體和半月牙變少等。同時,不同時間段(24h、48h和72h)轉染dsRNA,應用DNA電泳檢測發(fā)現(xiàn)轉染Cyt-c dsRNA的細胞DNA片段化程度相對較低。
　　 采用Annexin V-FITC和PI對處理細胞進行雙染色。流式細胞儀檢測到轉染eGFP dsRNA48h、Cyt-c dsRNA48h然

6、后接種病毒和只加病毒處理的細胞凋亡率分別約為67.49％、51.88％和63.2％。
　　 利用caspase-9的特異性底物與提取蛋白反應后,熒光分光光度計測值。正常細胞的caspase-9值很低。轉染eGFP dsRNA48h、Cyt—c dsRNA48h然后接種病毒和只加病毒處理的caspase-9活性約分別為108.3、72和102.3。顯然,沉默細胞色素的表達抑制caspase-9活性說明caspase-9活性是細胞色