AfMNPV誘導凋亡SL-1細胞中凋亡體的研究.pdf

1、細胞凋亡是多細胞動物中一種進化上保守的，用來清除衰老損傷細胞的一種機制。對于哺乳動物細胞中凋亡信號通路的研究，已經(jīng)比較清楚，研究表明主要存在外源性信號通路和內(nèi)源性信號通路。其中在內(nèi)源性信號通路中，線粒體通過釋放像細胞色素C(cytochrome c)這樣的死亡因子來執(zhí)行細胞凋亡。cytochrome c一旦從線粒體中釋放出來便會同Apaf-1結合并在dATP的參與下募集procaspase-9(形成凋亡體)導致其活化，并引發(fā)隨后的效應c

2、aspase活化的級聯(lián)反應，其中凋亡體起著重要的作用。
　　 我們以前的研究表明芹菜夜蛾核型多角體病毒(AfMNPV)能誘導鱗翅目斜紋夜蛾Sl-1細胞發(fā)生凋亡，并發(fā)現(xiàn)在凋亡過程中會出現(xiàn)線粒體膜電位降低，cytochromec從線粒體釋放至細胞質(zhì)基質(zhì)的現(xiàn)象，表明其凋亡信號通路同哺乳動物線粒體信號通路相似。為了進一步闡明AfMNPV或放線菌素D誘導SL-1細胞凋亡的凋亡機制，本文對AfMNPV或放線菌素D在誘導SL-1細胞凋亡過程中

3、，線粒體信號通路中組成凋亡體的各個組分進行了初步探究。運用western Blot技術檢測到了SL-1細胞中組成凋亡體的三種組分：Apaf-1，caspase-9和cytochrome c，運用Co-IP技術發(fā)現(xiàn)了Apaf-1同caspase-9之間的相互作用，并測定了caspase酶活性等，初步探究了凋亡體的抑制劑5’對氟磺酰苯甲酰腺苷鹽酸鹽(FSBA)對桿狀病毒或放線菌素D誘導SL-1細胞凋亡的影響。
　　 1、AfMNPV

4、或放線菌素D誘導SL-1細胞凋亡過程中凋亡體各個組分的表達情況及caspase酶活性分析
　　 通過Western Blot結果顯示，AfMNPV誘導SL-1細胞凋亡6h時細胞質(zhì)中Apaf-1的含量會升高，procaspase-9的含量由于活化而降低，并且隨著時間的延長而逐漸降低；cytochrome c會從線粒體中釋放出來導致其含量升高。放線菌素D處理組的結果同AfMNPV類似，不同之處是procaspase-9會在處理后6h

5、表達量升高，隨后才下降。通過Co-IP技術可以檢測到在AfMNPV(或放線菌素D)誘導SL-1細胞凋亡12h時Apaf-1和procaspase-9的相互作用。
　　 通過對SL-1細胞凋亡過程中caspase-9，caspase-3酶活性的測定發(fā)現(xiàn)，AfMNPV(或放線菌素D)在誘導SL-1細胞凋亡過程6h均能出現(xiàn)caspase-9，caspase-3活化的現(xiàn)象。caspase-9的酶活力隨著時間的延長而緩慢升高。AfMNPV

6、處理組的caspase-3酶活在18h時還有較高的酶活力，放線菌素D處理組caspase-3酶活則在6h和12h時較高。
　　 2.FSBA對AfMNPV或放線菌素D誘導的SL-1細胞凋亡的抑制作用
　　 FSBA是凋亡體抑制劑，細胞在最終濃度為50μM、100μM和200μM FSBA存在條件下，AfMNPV或放線菌素D誘導的SL-1細胞凋亡，細胞經(jīng)DAPI染色，顯微觀察發(fā)現(xiàn)，不同濃度的FSBA均能抑制桿狀病毒或放線菌