SfaMNPV誘導(dǎo)的SL-1細(xì)胞凋亡及EndoG的檢測(cè).pdf

1、本實(shí)驗(yàn)采用SfaMNPV誘導(dǎo)的SL-1細(xì)胞的凋亡，研究了SL-1細(xì)胞凋亡的特征，檢測(cè)了SL-1細(xì)胞中是否存在核酸內(nèi)切酶G(EndonucleaseG)，初步探究了昆蟲(chóng)細(xì)胞中是否存在起源于線粒體的非caspase依賴性的凋亡途徑。主要結(jié)果如下： (1)SfaMNPV誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞出現(xiàn)了典型的凋亡特征SfaMNPV能在Tn-581細(xì)胞中有效增值，測(cè)得病毒滴度為2.41X10<'7>pfu/ml。SfaMNPV誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞產(chǎn)生了

2、典型細(xì)胞凋亡特征。病毒處理細(xì)胞8-16h在光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞膜表面突出或形成小泡，細(xì)胞形成了大量的凋亡小體；24h后，細(xì)胞幾乎全部破裂成凋亡小體。DAPI熒光染色顯示感染細(xì)胞核逐漸變形，直至破裂成小塊而被凋亡小體包裹。凋亡細(xì)胞DNA瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)典型凋亡細(xì)胞DNA梯形電泳譜帶，且誘導(dǎo)時(shí)間越長(zhǎng)，梯型條帶越明顯。用流式細(xì)胞儀對(duì)線粒體膜電位(△Ψm)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，細(xì)胞經(jīng)羅丹明(Rho-123)染色后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，處理2小時(shí)后即出現(xiàn)

3、熒光強(qiáng)度下降，說(shuō)明膜電位下降是細(xì)胞凋亡的早期事件，細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體膜電位下降且呈時(shí)間依賴性。 (2)EndoG可能不存在于SL-1細(xì)胞中對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡研究表明：EndoG屬于Mg<'2+>依賴性DNA/RNA非特異性核酸酶重要家族，由核基因編碼，在細(xì)胞質(zhì)中翻譯成前體蛋白，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體中切割掉其N端48個(gè)氨基酸變?yōu)槌墒祗w．它是線粒體特異性核酸酶，在凋亡刺激下，一旦EndoG從線粒體膜間隙釋放，能夠切割細(xì)胞核染色質(zhì)DNA

4、,產(chǎn)生以核小體DNA長(zhǎng)度為基數(shù)的DNA片段，這一過(guò)程是不依賴caspase活化的。 采甩western blotting檢測(cè)SfaMNPV誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡后，是否存在EndoG的釋放，以及它在SL-1細(xì)胞線粒體和細(xì)胞質(zhì)中的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在凋亡的SL-1細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及線粒體組分中均未檢測(cè)到EndoG。由此表明在SfaMNPV誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞凋亡中可能不存在EndoG從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中并最終作用細(xì)胞DNA的事件，提示