AIF和EndoG介導(dǎo)的線粒體相關(guān)問號鉤端螺旋體誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡的研究.pdf

1、目的：致病性問號鉤端螺旋體(簡稱鉤體)可以在體外誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細胞系J774A.1細胞凋亡，但是具體的凋亡機制還未闡明。本研究的目的是探討AIF和EndoG線粒體相關(guān)途徑在問號鉤體誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡中的作用。
　　 方法：⑴致病性問號鉤體黃疸出血群賴型賴株體外誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡：鉤體分別與小鼠腹腔巨噬細胞(MPMs)，小鼠單核巨噬樣細胞系J774A.1細胞，人單核樣細胞系THP-1細胞，共同孵育。采用AnnexinV-FITC和

2、PI雙染法，通過流式細胞儀檢測鉤體感染后巨噬細胞凋亡率。⑵透射電鏡觀察誘導(dǎo)凋亡的巨噬細胞超微結(jié)構(gòu)改變，尤其是線粒體改變。⑶應(yīng)用活性檢測試劑盒測定鉤體感染后的巨噬細胞的caspase-8，caspase-9活性變化；非特異性Caspase阻斷劑對凋亡的影響；JC-1染色后流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測線粒體膜電位(MPT)變化，應(yīng)用熒光探針DCFH-DA檢測細胞內(nèi)的活性氧(ROS)水平。⑷Western blot分別檢測誘導(dǎo)鉤體感染后的巨噬細

3、胞在感染不同時間后的線粒體或胞漿成份中的細胞色素C，EndoG，AIF和Smac的表達，同時應(yīng)用免疫熒光染色法檢測相應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)位。MPT阻斷劑預(yù)處理細胞后，對凋亡及線粒體釋放蛋白的影響。(5)應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測鉤體感染后的巨噬細胞的凋亡相關(guān)基因Bcl-2家族的mRNA表達水平變化，對表達發(fā)生變化的及代表性Bcl-2家族基因的應(yīng)用Real-time PCR再次確認mRNA水平變化。
　　 結(jié)果：①致病性問號鉤體黃疸出血群賴型賴株

4、體外能成功誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡，顯示問號鉤體賴株可誘導(dǎo)3種巨噬細胞均出現(xiàn)不同程度的細胞凋亡，細胞凋亡率在一定范圍內(nèi)，隨著感染時間延長和感染菌量的增加而升高。但是感染菌量過高時，細胞凋亡率開始下降，同時細胞壞死率升高。②透射電鏡結(jié)果顯示：感染問號鉤體后，3種巨噬細胞均出現(xiàn)細胞凋亡的特征，例如染色質(zhì)濃縮和邊緣化，新月形核，細胞空泡化，細胞線粒體腫脹和嵴消失，但是3種被感染巨噬細胞的形態(tài)改變之間無明顯差異。③問號鉤體賴株感染3種巨噬細胞后，均可檢

5、測到caspase-8活性明顯升高，caspase-9活性無明顯升高；但是非特異性caspase抑制劑不能完全阻斷細胞凋亡。被鉤體感染后，3種巨噬細胞線粒體膜電位均隨著感染時間的延長而逐漸下降。其中，MPMs的MPT下降幅度大于J774A.1和THP-1細胞。此外，與正常對照細胞相比，被鉤體感染的3種巨噬細胞均出現(xiàn)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平升高。④Westem Blot顯示，在問號鉤體賴株誘導(dǎo)3種巨噬細胞凋亡的過程中，在MPMs和J774

6、A.1細胞中檢測到AIF和EndoG從線粒體釋放到胞漿，在THP-1細胞中檢測到AIF從線粒體釋放到胞漿；但是未檢測到細胞色素C和Smac從線粒體釋放到胞漿。但是免疫熒光染色證實鉤體感染后AIF或EndoG從線粒體轉(zhuǎn)位到細胞核，從而誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生。MPT阻斷劑可以部分性阻斷細胞凋亡，完全阻斷AIF或EndoG的釋放。⑤線粒體相關(guān)的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，Bcl-2家族的mRNA表達水平檢測結(jié)果顯示：鉤體感染后3種巨噬細胞后，Bcl-2家族抗凋

7、亡基因Bcl-2，Bcl-XL均無明顯變化，但是促凋亡基因Bid，Bikl，Bnip3，Bcor，Bcl-211和Bclafl在MPMs和J774A.1細胞中表達明顯上調(diào)，促凋亡基因Bid， Bikl，Bnip3， Bcl-211和Bclafl在THP-1細胞中小幅上調(diào)，其他促凋亡基因無明顯變化。
　　 結(jié)論：⑴致病性的問號鉤體黃疸出血群賴型賴株可以誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡。⑵問號鉤體賴株通過caspase依賴的caspase-8途徑和