問號(hào)鉤端螺旋體內(nèi)化過程中細(xì)胞骨架變化及相關(guān)信號(hào)通路.pdf

1、背景和目的 鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)病是全世界流行的人獸共患病，我國也是鉤體病流行的主要疫區(qū)。鉤體通過皮膚黏膜，迅速進(jìn)入血液，并在血液和組織內(nèi)生長繁殖，造成機(jī)體損傷，引起一系列癥狀和體征。其臨床綜合癥包括亞臨床感染、伴或不伴有腦膜炎的無黃疸的自限性發(fā)熱、潛在性致命的以出血、黃疸、腎衰竭為表現(xiàn)的Weil's綜合癥。鉤體在感染動(dòng)物腎臟組織內(nèi)長期生存并不斷隨尿排出，提示鉤體必然具有侵入宿主細(xì)胞的能力，但確切的致病機(jī)制至今未明。 有文獻(xiàn)

2、報(bào)道，問號(hào)鉤體可黏附并侵入細(xì)胞，進(jìn)一步研究結(jié)果證實(shí)，強(qiáng)毒力和弱毒力問號(hào)鉤體均能侵入J774A.1及Vero細(xì)胞，前者還可侵入細(xì)胞核，而無毒力的雙曲鉤體缺乏侵入細(xì)胞的能力。近年來報(bào)道，許多致病菌黏附宿主細(xì)胞后能引起Ca2+升高，Ca2+可以觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞骨架重排，最終導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)化入細(xì)胞。鉤體內(nèi)化細(xì)胞時(shí)能否觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞骨架重排，尚需要研究。 在以往工作基礎(chǔ)上，本研究用微絲(F-actin)的特異性標(biāo)

3、記物，羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Phalloidin-TRITC)染F-actin，用抗微管蛋白α亞單位的小鼠一抗(Anti-Bovineα-Tubulin，MouseMonoclonal)和熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(FITC-conjugatedAffniPureGoatAnti-MouseIgG)染微管(microtubule)，檢測(cè)了不同毒力的鉤體侵入宿主細(xì)胞時(shí)細(xì)胞骨架的改變情況，并用磷脂酶C(PLC)信號(hào)傳導(dǎo)分子的特異性阻斷劑U73

4、122抑制磷脂酶C信號(hào)通路，觀察其對(duì)細(xì)胞骨架改變的影響。 方法 將Vero和J774A.1細(xì)胞單層培養(yǎng)，用Phalloidin-TRITC避光染色60min，置于熒光顯微鏡下，激發(fā)波長510nm，發(fā)射波長620nm，顯示正常Vero和J774A.1細(xì)胞的F-actin細(xì)胞骨架；用Anti-Bovineα-Tubulin和FITC-conjugatedAffniPureGoatAnti-MouseIgG避光染色60min，置于熒

5、光顯微鏡下，激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長520nm，顯示正常Vero和J774A.1細(xì)胞的tubulin細(xì)胞骨架，之后加入問號(hào)鉤體黃疸出血群賴型56601株和波摩那群波摩那型56608株，觀察Vero和J774A.1細(xì)胞F-actin細(xì)胞骨架和tubulin細(xì)胞骨架的變化。用PLC抑制劑U73122預(yù)處理Vero細(xì)胞，觀察其對(duì)鉤體感染細(xì)胞觸發(fā)F-actin細(xì)胞骨架變化的影響。 結(jié)果 問號(hào)鉤體黃疸出血群56601株和波摩那群56

6、608株鉤體感染Vero和J774A.1細(xì)胞后，不能引起兩種細(xì)胞tubulin細(xì)胞骨架的重排，也不能引起J774A.1細(xì)胞F-actin細(xì)胞骨架的重排，但是能引起Vero細(xì)胞F-actin細(xì)胞骨架的重排，表現(xiàn)為肌動(dòng)蛋白的點(diǎn)狀聚集，正常的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失。鉤體56601株感染15分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘時(shí)的F-actin重排百分率明顯不同，分別為69.67±2.02％、79.33±0.76％、55.5±2.17％和43.83±0.

7、57％(P＜0.01)，PLC信號(hào)傳導(dǎo)通路阻斷后分別為24.67±0.76％、27.83±4.54％、21.5±1％和19.83±4.01％；鉤體56608株感染15分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘時(shí)的F-actin重排百分率也明顯不同，分別為62.17±0.76％、73±2.5％、49.33±1.61％和35.33±2.02％(P＜0.01)，PLC信號(hào)傳導(dǎo)通路阻斷后分別為21.67±1.61％、21.67±1.76％、18.33

8、±0.76％和17.33±2.75％。感染15分鐘、30分鐘時(shí)的重排百分率明顯高于60分鐘和120分鐘，而且感染60分鐘以后肌動(dòng)蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)又會(huì)有所恢復(fù)。強(qiáng)毒力的56601株觸發(fā)的actin肌動(dòng)蛋白重排率要稍高于弱毒力的56608株(P＜0.05)，此外在鉤體感染的同一時(shí)間點(diǎn)，PLC信號(hào)傳導(dǎo)通路阻斷前后F-actin的重排百分率也明顯不同，阻斷后明顯低于阻斷前(P＜0.01)。 結(jié)論 鉤體感染細(xì)胞并引起F-actin細(xì)胞骨架