細胞色素C在無細胞體系中對斜紋夜蛾細胞凋亡的影響.pdf

1、細胞凋亡是當今生命科學研究的熱點，科學技術的進步與發(fā)展為細胞凋亡的研究提供了有力武器。比如無細胞體系，在細胞凋亡的應用中有不可取代的優(yōu)越性。無細胞體系最初主要應用于細胞重大生命活動的機理研究。例如在亞細胞水平和分子水平上研究細胞核的體外重建、細胞周期的調控等。1993年，lazebnik等科學家首次將其應用于細胞凋亡的研究。無細胞體系在哺乳動物細胞和植物細胞凋亡的應用中已經取得了很多成果，但在昆蟲細胞凋亡的應用中還正在深入。本文應用無細

2、胞體系對昆蟲細胞凋亡的有關方面進行了探討和研究。我們以前的研究結果已證明，桿狀病毒中的芹菜夜蛾核型多角體病毒SfMNPV和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcMNPV誘導的斜紋夜蛾（Spodoptera litura） S1-1細胞凋亡過程中，細胞色素C（cytc）從線粒體釋放至胞質是細胞凋亡的關鍵步驟。本實驗以S1-1細胞核為研究對象，用S1-1細胞漿制備的無細胞體系作為反應體系。在無細胞體系中以純化的外源cytc作為誘導劑，誘導S1-1細

3、胞核發(fā)生凋亡，研究了S1-1胞核凋亡的特征，進一步探究了cytc在昆蟲細胞凋亡中的作用。主要工作包括以下幾個方面： （1）外源cytc對S1-1細胞核的影響 細胞凋亡形態(tài)學判斷是凋亡檢測的經典標準，最為常用及最為簡便的方法是使用熒光顯微鏡觀察細胞核的凋亡過程。本實驗采用DAPI染料，直接對細胞核進行染色，用熒光顯微鏡觀察細胞核的形態(tài)變化。由于凋亡相關的特異核酸酶對細胞核染色質DNA進行特異切割，經瓊脂糖凝膠電泳可見典型的

4、梯形圖譜。這是細胞凋亡一個強有力的生化指標。本實驗提取凋亡細胞核DNA進行凝膠電泳，檢測其DNA變化。通過上述兩種方法研究了細胞色素C誘導S1-1細胞核發(fā)生凋亡的作用。 結果表明，一定濃度的外源cytc將無細胞體系激活為凋亡體系，細胞核在凋亡體系中，置28℃培養(yǎng)箱，分別孵育2hr，4hr，6hr，8hr。DAPI染色結果顯示細胞核固縮并逐漸變形，核內染色質凝集并趨邊化，有空泡形成。隨著孵育時間的延長細胞核直至破裂成大量的小塊而被

5、核膜包裹，類似于凋亡體。細胞核孵育12 hr之后，熒光顯微鏡下幾乎看不到完整的細胞核，整個視野中充滿高亮度的細小的熒光球。這說明cytc可誘導S1-1細胞核發(fā)生凋亡。提取凋亡細胞核DNA經瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)典型的凋亡細胞DNA梯形電泳譜帶，且細胞核孵育時間越長，電泳梯形條帶越明顯。結果進一步證實了cytc可誘導S1-1細胞核發(fā)生凋亡。 （2） cytc對caspase-3活性的影響 檢測細胞凋亡的另外一個重要生化指標是檢

6、測胱天蛋白酶的活性。如caspase-3，caspase-8，caspase-9等在細胞凋亡過程中被激活，由無活性的酶原成為有活性的酶。活化的caspase對其底物具有特異性切割性，通過這一特性來檢驗相應的胱天蛋白酶的活性。本實驗應用熒光定量技術檢測cytc誘導S1-1細胞核發(fā)生凋亡過程中caspase-3的活性變化。分別在孵育不同時間的凋亡體系中加入等量的caspase-3的特異性底物Asp-Glu-Val-Asp（DVED），根據底