細胞色素C質(zhì)量研究.pdf

1、細胞色素 C（Cytochrome C）是從豬、牛等哺乳動物心肌細胞中提取的蛋白酶。在生物氧化過程中起著傳遞電子的作用，臨床上主要用于各種組織缺氧（如腦缺氧、一氧化碳中毒及心臟疾病引起的缺氧等）的急救。細胞色素 C屬于酶類品種，是大分子組織提取物，具有藥用酶的特性，遇酸、堿、金屬離子等因素易變性失活，純度不確定且多種未知的雜質(zhì)，現(xiàn)行標準很不完善。本論文主要針對細胞色素 C質(zhì)量標準中存在鑒別、含量和生物活性檢測等質(zhì)控難點進行研究。

2、　　第一部分，采用胰蛋白酶酶解細胞色素 C得到細胞色素 C酶切肽段，將酶切肽段采用RP-HPLC進行分離分析，得到穩(wěn)定的細胞色素 C肽圖譜，建立細胞色素 C RP-HPLC肽圖分析方法。研究發(fā)現(xiàn)三種不同心來源的細胞色素 C肽圖存在較大差異。故肽圖分析方法可用于細胞色素 C種屬鑒別，并可用于考察產(chǎn)品與對照品之間的同質(zhì)性及不同批次間的一致性。
　　第二部分，采用SDS-PAGE、凝膠色譜法和反相高效液相色譜法三種不同分析原理的方法測定

3、細胞色素 C與雜質(zhì)，篩選出分離效果好的反相 HPLC法測定細胞色素 C含量。對色譜柱、流動相、梯度洗脫等分析條件進行摸索和優(yōu)化，建立細胞色素 C RP-HPLC含量測定方法。此方法專屬性高、準確性和重現(xiàn)性好，可用于細胞色素 C含量測定。
　　第三部分，采用TMB底物生色法、呼吸活性測定方法（Warburg法）和酶可還原率法測定細胞色素 C的活性。三種方法在原理、測定條件、計算方法等方面差異較大。酶可還原率法依據(jù)在琥珀酸脫氫酶作用下

4、被琥珀酸還原的吸光度與被化學物質(zhì)還原的吸光度之比，為細胞色素 C活力，操作步驟繁瑣，琥珀酸脫氫酶活力、鐵氰化鉀的量和輔料均影響檢測結(jié)果的準確性；Warburg法采用微量呼吸檢壓儀檢測細胞色素 C促進細胞呼吸的活性，但此方法需要專用設備，操作繁瑣，豚鼠個體差異與肝細胞制備及輔料均對檢測產(chǎn)生一定的干擾；而研究建立的TMB底物生色法檢測細胞色素 C對底物發(fā)生酶促反應的催化能力，該方法試劑用量少、專屬性高、重現(xiàn)性好且結(jié)果穩(wěn)定可靠。
　　第

5、四部分，篩選出合適的細胞色素 C原料，經(jīng)結(jié)構(gòu)確證、純度檢查、活力、含量及理化分析，建立細胞色素 C工作標準品。
　　針對現(xiàn)有細胞色素 C及其制劑質(zhì)量標準存在的問題和不足，本文研究建立細胞色素 C RP-HPLC肽圖鑒別、含量測定和TMB底物生色法，國內(nèi)均未見文獻報道；研究建立了用于鑒別、含量和活性測定的細胞色素 C工作標準品。根據(jù)研究結(jié)果，對現(xiàn)行質(zhì)量標準進行修訂，擬訂了細胞色素 C溶液及制劑的質(zhì)量標準草案。在擬訂的標準草案中新增了