具有不同疏水性的聚陰離子誘導(dǎo)脫輔基細(xì)胞色素c和細(xì)胞色素c的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換.pdf

1、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換(折疊與去折疊)是蛋白質(zhì)研究的重要領(lǐng)域。蛋白質(zhì)的正確折疊是體現(xiàn)其生物功能的基礎(chǔ)，也是生物學(xué)中最基本和最普遍的自組裝模式。蛋白質(zhì)肽鏈在體內(nèi)如何折疊主要取決于其一級結(jié)構(gòu)和肽鏈所位于的細(xì)胞環(huán)境，一般來說，蛋白質(zhì)能自發(fā)地折疊成具有特定空間結(jié)構(gòu)和生物功能的分子。但是環(huán)境因素的改變會使肽鏈發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，也就是說蛋白質(zhì)采取何種空間結(jié)構(gòu)不但受肽鏈自身熱力學(xué)穩(wěn)定性的控制，還受到蛋白質(zhì)分子所處的微環(huán)境和動力學(xué)過程的影響。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換在生

2、物體內(nèi)是一個普遍現(xiàn)象，近年來的醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在人體內(nèi)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換和錯誤折疊會引起嚴(yán)重的疾?。涣硪环矫妫亟M蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的高效表達(dá)常常導(dǎo)致無活性的變性蛋白質(zhì)聚集體，即包涵體的生成。因此，研究蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理和發(fā)展促使蛋白質(zhì)復(fù)性的方法無論在理論上還是在應(yīng)用上都有很重要的意義。 在細(xì)胞內(nèi)，有一類稱為分子伴侶(molecularchaperone)的蛋白質(zhì)分子協(xié)助新生肽鏈進(jìn)行正確的非共價鍵組裝。分子伴侶對其靶蛋白并沒有特異性識

3、別，本身不參與最終產(chǎn)物的形成，也不包括控制正確折疊所需要的構(gòu)象信息，而只是阻止非天然的多肽鏈內(nèi)部或多肽鏈之間不正確的相互作用。分子伴侶協(xié)助蛋白質(zhì)折疊的方法為蛋白質(zhì)復(fù)性提供了一個可能性。90年代初，Cleland及合作者報道了兩親性的合成高分子聚乙二醇(PEG)可以作為蛋白質(zhì)折疊促進(jìn)劑。近年來，又有一些關(guān)于高分子作為折疊促進(jìn)劑的報道。隨著高分子科學(xué)的迅速發(fā)展，已經(jīng)可以按照高分子功能性的要求設(shè)計和合成出具有指定單體單元結(jié)構(gòu)、鏈結(jié)構(gòu)、分子量的

4、多種均聚物、無規(guī)共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物等。尤其重要的是，可以通過分子設(shè)計將具有環(huán)境響應(yīng)性質(zhì)的疏水和親水的結(jié)構(gòu)單元以不同的組合方式連接于合成高分子中，它們不但在單分子狀態(tài)具有可調(diào)節(jié)和環(huán)境響應(yīng)的結(jié)構(gòu)變換及疏水—親水平衡，還能形成可控尺寸的自組裝。因此，可以利用不同的合成高分子研究各種作用力對蛋白質(zhì)折疊的影響，并尋找合成高分子促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊的結(jié)構(gòu)模式。在本論文中，用磺化聚苯乙烯、馬來酸—烯烴交替共聚物研究了靜電、疏水作用和氫鍵對細(xì)胞色

5、素c和脫輔基細(xì)胞色素c結(jié)構(gòu)的影響。細(xì)胞色素c是一個堿性蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)為pH10．6；脫輔基細(xì)胞色素c是細(xì)胞色素c的前體蛋白質(zhì)，不含輔基血紅素，在溶液中以無規(guī)卷曲構(gòu)象形式存在。 論文工作的第一部分研究了磺化聚苯乙烯和脫輔基細(xì)胞色素c的相互作用。龔潔在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)磺化聚苯乙烯可以誘導(dǎo)脫輔基細(xì)胞色素c從無規(guī)卷曲構(gòu)象折疊為α-螺旋結(jié)構(gòu)。脫輔基細(xì)胞色素c的α-螺旋含量與磺化聚苯乙烯的分子量、磺化度、濃度以及溶液的pH、離子強(qiáng)度有關(guān)。

6、在此基礎(chǔ)上，我用動態(tài)光散射、熒光光譜和原子力顯微鏡方法對磺化聚苯乙烯和脫輔基細(xì)胞色素c的相互作用進(jìn)行了進(jìn)一步地表征。我們發(fā)現(xiàn)，滴加磺化聚苯乙烯溶液(THF／H20，50／50，v／v)到水溶液中可以形成納米粒子，粒子表面的磺酸負(fù)電荷使其穩(wěn)定地分散在水溶液中；粒徑的火小與聚合物濃度和低濃度的鹽無關(guān)，但隨溶液pH的增加而增加。在酸性和中性溶液中磺化聚苯乙烯和脫輔基細(xì)胞色素c發(fā)生相互作用形成復(fù)合物粒子，其尺寸與兩者的濃度比有關(guān)。當(dāng)磺化聚苯乙烯

7、過量時，富集在復(fù)合物粒子表面的負(fù)電荷阻止了粒子的進(jìn)一步聚集；而當(dāng)脫輔基細(xì)胞色素c過量時，脫輔基細(xì)胞色素c可能促使復(fù)合物粒子進(jìn)一步聚集。以芘為探針的熒光光譜表明，脫輔基細(xì)胞色素c不僅中和了磺化聚苯乙烯粒子表面的負(fù)電荷，而且可能插入其疏水內(nèi)核，破壞了磺化聚苯乙烯粒子的原始結(jié)構(gòu)，這類似于脫輔基細(xì)胞色素c與磷脂的反應(yīng)。因此，磺化聚苯乙烯粒子可以部分地模擬磷脂膜的微環(huán)境。 論文工作的第二部分研究了馬來酸—烯烴交替共聚物對脫輔基細(xì)胞色素c結(jié)

8、構(gòu)轉(zhuǎn)換的影響。馬來酸—烯烴交替共聚物的疏水—親水性可以通過選擇不同長度的疏水側(cè)鏈和溶液的pH來進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此是研究靜電、疏水和氫鍵作用對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換影響的一個很好模型。在這里，我選擇了馬來酸一十四烯交替共聚物(PTMA)和馬來酸—異丁烯交替共聚物(PIMA)來研究對脫輔基細(xì)胞色素c折疊的誘導(dǎo)作用。在pH為2．1，6．5，10．5和11．8溶液中，PIMA的電離度分別為11％，53％，87％和100％；PTMA電離度分別為8％，55％，

9、97％和100％。在水溶液中，親水的PIMA鏈主要采取伸展的構(gòu)象；而疏水的PTMA聚集形成膠束，位于膠束表面的羧酸根負(fù)離子使膠束穩(wěn)定。當(dāng)溶液中PTMA濃度降低和pH增大時，膠束會發(fā)生解離。圓二色性光譜、熒光光譜和原子力顯微鏡研究表明，當(dāng)溶液pH從酸性變到堿性時，脫輔基細(xì)胞色素c從伸展的無規(guī)卷曲構(gòu)象，即UA態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂臒o規(guī)卷曲構(gòu)象，即C態(tài)。加入馬來酸—烯烴交替共聚物后，脫輔基細(xì)胞色素c從無規(guī)卷曲構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋結(jié)構(gòu)。α-螺旋含量與共聚

10、物的濃度、疏水鏈的長度以及溶液的pH有關(guān)。在pH2．1時，每個脫輔基細(xì)胞色素c分子帶有24個正電荷，因此共聚物和蛋白質(zhì)之間的靜電吸引作用可以削弱肽鏈內(nèi)的靜電斥力，有利于蛋白質(zhì)折疊。在pH11．8時，共聚物和蛋白質(zhì)都帶負(fù)電荷，PIMA的烷基側(cè)鏈太短，不能誘導(dǎo)脫輔基細(xì)胞色素c折疊；而帶有十四烷基側(cè)鏈的PTMA仍然可以誘導(dǎo)脫輔基細(xì)胞色素c形成α-螺旋結(jié)構(gòu)，說明疏水作用也是誘導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊的一個重要因素。蛋白質(zhì)和共聚物之間的靜電和疏水作用排擠了與

11、蛋白質(zhì)結(jié)合的水分子，減少了蛋白質(zhì)與水分子之間的氫鍵，促進(jìn)了肽鏈內(nèi)部氫鍵，從而有利于α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成。另外，共聚物中離子化的羧酸基團(tuán)可以和蛋白質(zhì)肽鏈上的酰胺基團(tuán)形成強(qiáng)氫鍵，抑制肽鏈內(nèi)氫鍵和α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成。動態(tài)光散射研究表明，在溶液pH小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時，當(dāng)正負(fù)電荷比接近化學(xué)計量時，共聚物和脫輔基細(xì)胞色素c相互作用會生成沉淀；否則，過量的脫輔基細(xì)胞色素c正電荷或過量的共聚物負(fù)電荷可以防止復(fù)合物的進(jìn)一步聚集而形成穩(wěn)定的粒子。在中性和堿性

12、溶液中，共聚物和蛋白質(zhì)之間的相互作用破壞了PTMA和脫輔基細(xì)胞色素c自身的疏水聚集，形成了新的聚集體。在體系中，共聚物與脫輔基細(xì)胞色素c之間的相互作用和共聚物與蛋白質(zhì)自身的疏水聚集之間存在競爭。相對于小分子折疊促進(jìn)劑，用高分子誘導(dǎo)蛋白質(zhì)折疊有兩個優(yōu)點(diǎn)：(1)濃度低；(2)相互作用可調(diào)。 論文工作的第三部分研究了在與馬來酸—烯烴交替共聚物結(jié)合和解離過程中細(xì)胞色素c結(jié)構(gòu)的可逆轉(zhuǎn)換。球蛋白與帶相反電荷的聚合物相互作用后，根據(jù)溶液中聚合

13、物與蛋白質(zhì)濃度以及溶液pH和離子強(qiáng)度的不同，可以生成可溶性的復(fù)合物、凝聚物或沉淀。因此，聚合物可以用來分離和純化蛋白質(zhì)、固定和穩(wěn)定酶、促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊、包埋與控制釋放蛋白質(zhì)。聚合物和蛋白質(zhì)之間可以發(fā)生靜電、疏水和氫鍵相互作用，而這些相互作用也是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要因素和誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的主要驅(qū)動力。據(jù)我們所知，目前還沒有關(guān)于聚合物和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合和釋放對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響的系統(tǒng)研究。因此，我用圓二色性光譜、吸收光譜和原子力顯微鏡研究了PI

14、MA與PTMA分別和細(xì)胞色素c結(jié)合和解離過程中靜電和疏水作用對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。在生理pH7．4時，PIMA僅部分地破壞了細(xì)胞色素c中血紅素疏水袋結(jié)構(gòu)的完整性而對色氨酸的不對稱環(huán)境沒有影響，而PTMA完全破壞了細(xì)胞色素c中血紅素疏水袋結(jié)構(gòu)的完整性和色氨酸的不對稱環(huán)境，即PTMA與細(xì)胞色素c之間的疏水作用完全破壞了細(xì)胞色素c的疏水核結(jié)構(gòu)。二者均對細(xì)胞色素c的二級結(jié)構(gòu)沒有明顯影響。在馬來酸—烯烴交替共聚物和蛋白質(zhì)復(fù)合物中，加入相當(dāng)于生理離子

15、強(qiáng)度的0．15MNaCl可以破壞PIMA和細(xì)胞色素c的復(fù)合物粒子，被釋放出的細(xì)胞色素c恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)；相反，由于PTMA和細(xì)胞色素c之間更強(qiáng)的疏水作用，0．15MNaCl對其沒有明顯的影響。加入0．5M鹽酸胍到PTMA和細(xì)胞色素c復(fù)合物中，鹽酸胍可以與PTMA發(fā)生靜電和疏水作用生成PTMA-鹽酸胍沉淀而將細(xì)胞色素c釋放出來，被釋放的細(xì)胞色素c恢復(fù)了天然結(jié)構(gòu)。這表明，聚合物可以通過疏水作用與蛋白質(zhì)形成更穩(wěn)定復(fù)合物，同時蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也被更嚴(yán)