O型口蹄疫病毒VP1蛋白表達(dá)及單克隆抗體的制備.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的一種烈性動物傳染病，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全，我國將其列為一類動物疫病。目前控制該病的主要方法是抗體檢測和疫苗免疫相結(jié)合。FMDV有7個血清型，不同血清型的FMDV之間無交叉保護(hù)性，引起我國牲畜發(fā)病的血清型主要有 O、A、AsiaⅠ三個血清型，其中 O型流行最為廣泛。VP

2、1蛋白作為O型FMDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，包含其中大部分刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的中和性抗原位點，分別位于羧基端200-213位氨基酸殘基的線性表位上、B-C環(huán)上和G-H環(huán)內(nèi)，因此VP1抗體作為FMDV免疫產(chǎn)生的主要中和抗體，是評估疫苗免疫效果的重要依據(jù)。本試驗將轉(zhuǎn)化了 VP1融合蛋白基因的JM109在 IPTG的誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)并進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化；以 VP1融合蛋白（rVP1蛋白）為包被抗原建立了間接 ELISA抗體檢測方法，以 PEG200

3、0為融合劑將免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，有限稀釋法篩選陽性克隆，制備單克隆抗體并進(jìn)行鑒定。試驗結(jié)果如下：
　　1、O型FMDV VP1基因的克隆與原核表達(dá)
　　參考 GeneBank上發(fā)表的O型 FMDV VP1基因序列，設(shè)計兩條特異性引物，通過 PCR擴(kuò)增，將其克隆至表達(dá)載體 pQE-30上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 JM109中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示：VP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小約為5

4、60 bp，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致；表達(dá)的O型rVP1蛋白大小約為26 kDa，純化效果較好，未見其他雜帶，蛋白濃度達(dá)2.85 mg/mL，說明 O型rVP1蛋白得到了高效地表達(dá)；Western-blot鑒定結(jié)果說明表達(dá)的O型rVP1蛋白具有很好的反應(yīng)原性。O型rVP1蛋白的成功表達(dá)為建立 O型FMDV VP1抗體血清學(xué)檢測方法打下了基礎(chǔ)。
　　2、間接ELISA檢測抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗體方法的建立
　　采用方陣滴定

5、法對抗原包被濃度、包被條件、血清稀釋濃度、酶標(biāo)二抗稀釋濃度、最適封閉劑進(jìn)行篩選，進(jìn)行特異性實驗。結(jié)果顯示:最佳包被抗原濃度為2.0μg/mL，最佳包被溫度和時間為4℃過夜，血清最適稀釋倍數(shù)為 l∶200，酶標(biāo)二抗最適稀釋倍數(shù)為l∶3000，最適封閉液為1％BSA-PBST溶液。該方法與A型FMDV、AsiaⅠ型FMDV、SVDV陽性血清不發(fā)生反應(yīng)，僅與O型FMDV陽性血清反應(yīng)，表明其特異性良好。本研究建立的間接 ELISA為我國O型FM

6、DV VP1抗體檢測提供了一種簡便快捷的檢測方法。
　　3、抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白單克隆抗體的鑒定及鑒定
　　本研究以高濃縮的O型FMDV滅活疫苗免疫 BALB/c小鼠，取陽性免疫鼠脾細(xì)胞與 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，采用間接 ELISA方法鑒定，經(jīng)4次亞克隆后，篩選能穩(wěn)定分泌抗O型FMDV VP1蛋白MAbs的雜交瘤細(xì)胞株。將雜交瘤細(xì)胞株注入小鼠腹腔制備腹水，選取腹水效價高的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行單抗亞型鑒定及純化；測定

7、雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目、相對親和力常數(shù)、特異性、穩(wěn)定性等生物學(xué)特性；采用阻斷ELISA試驗檢測單抗與O型FMDV反應(yīng)的特異性。結(jié)果：篩選出了1株可穩(wěn)定分泌抗 O型 FMDV VP1蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株（1C7），1C7的染色體數(shù)高于任一親本細(xì)胞的染色體數(shù)目；腹水的抗體效價為1:105，濃度為4.7 mg/mL。1C7分泌的MAbs亞型鑒定為IgG2b；相對親和力常數(shù)為1.5 mol/L；間接 ELISA試驗結(jié)果表明其可以特異性地與 O

8、型 FMDV反應(yīng)，而與 A型、AsiaⅠ型 FMDV及豬水泡病病毒均不發(fā)生交叉反應(yīng)；Western-blot試驗結(jié)果表明MAbs可特異性與原核表達(dá)的O型重組VP1蛋白（O-rVP1）反應(yīng)；雜交瘤細(xì)胞傳代至30代、在液氮中凍存12月后復(fù)蘇，其分泌抗體穩(wěn)定；阻斷 ELISA試驗表明1C7單抗能夠被 O型 FMDV免疫血清特異性地阻斷。本研究為進(jìn)一步建立基于單抗檢測O型FMDV抗體和病原的阻斷ELISA及膠體金免疫層析快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。