牛細小病毒檢測試劑的制備及快速檢測方法的建立.pdf

1、牛細小病毒感染(Bovine parvovirus infection)是由牛細小病毒(Bovine parvovirus，BPV)引起牛的一種主要以母牛生殖機能障礙和犢牛消化道、呼吸道癥狀為特征的傳染性疾病。1961年Abinanti和Warfield首次從健康犢牛糞便中分離出細小病毒。因其具有血細胞吸附性能，故又稱血細胞吸附腸病毒(Hemadsorbing enteric，HADEN)。其后從暴發(fā)BPV感染的牛群中進行病毒的分離鑒定

2、和血清學調(diào)查，結(jié)果表明在一些牛群中BPV感染發(fā)病率較高，亦有血清學調(diào)查報道目前該病屬全球范圍流行。目前，我國對牛細小病毒及其感染研究較少，我國牛群是否存在細小病毒感染，其感染和危害的程度如何，尚缺乏較為清晰的背景資料。實踐中缺乏檢測BPV感染的抗原與抗體試劑也制約了我國對該病的檢測。因此研究開發(fā)出檢測BPV感染特異性強、敏感性高的病原和血清檢測試劑顯得尤為重要。
　　 首先，本研究根據(jù)GenBanK上公布的BPV基因組序列，選取

3、VP2基因高度保守區(qū)域作為靶基因，通過生物學軟件設計篩選出1套LAMP引物。以BPV原代細胞培養(yǎng)物提取DNA為模板，建立BPV-LAMP檢測方法，并對反應溫度、時間、鎂離子濃度等條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，LAMP最佳反應溫度是63℃，反應時間為60min，鎂離子濃度為8mM/L，甜菜堿濃度為1.2mM/L，F(xiàn)IP和BIP的濃度分別為1.6μM/L，F(xiàn)3和B3的濃度分別為0.2μM/L，內(nèi)外游引物濃度比為8:1。經(jīng)過優(yōu)化后初步建立的BPV-

4、LAMP方法，最低可檢測到9個拷貝的BPV DNA，是普通PCR方法敏感性的100倍。與可能存在交叉反應的病毒進行特異性試驗，只有BPV擴增出特異性條帶，而其他病毒(BRV、BVDV、BHV、GPV、PPV)均為陰性，無交叉反應。表明建立的BPV-LAMP方法具有良好的敏感性和特異性。此方法可根據(jù)反應后的擴增產(chǎn)物是否變渾濁判定結(jié)果，或加入SYBR GreenⅠ染料，在自然光或紫外光下判定結(jié)果。采用LAMP和PCR同時檢測59份糞便樣本，

5、兩種方法檢測結(jié)果的符合率為94.9％。結(jié)果表明，建立的BPV-LAMP具有快速、敏感、特異、重復性好等優(yōu)點，可用于臨床BPV感染的檢測。
　　 本研究根據(jù)GenBanK上公布的BPV VP2基因設計引物，以BPV-VR767株的DNA為模板，采用PCR擴增出2019 bp的VP2基因，利用生物學軟件對VP2基因序列進行抗原性預測分析，選擇抗原性優(yōu)勢區(qū)域，將VP2基因分為三段(34～263aa，300～451aa和484～633a

6、a)，分別克隆到原核表達載體pET-28a上，獲得了重組質(zhì)粒pET-28a-VP2-1、pET-28a-VP2-2和pET-28a-VP2-3，將其分別轉(zhuǎn)化E.coli BL21或Rosetta，經(jīng)IPTG誘導后，分別得到大小為30.2ku、22.7ku和22.9 ku的目的蛋白。經(jīng)Western-blot和間接ELISA分別檢測三個重組蛋白的反應原性；用純化的三個重組蛋白分別免疫昆明鼠，利用間接ELISA檢測抗體產(chǎn)生的效價和特異性識別

7、重組抗原的能力，評價其免疫原性。結(jié)果顯示，Western-blot和間接ELISA證實BPV陽性血清均能夠識別三個重組蛋白，表明表達的三個重組蛋白均具有抗原性；免疫小鼠中均產(chǎn)生特異性抗體，血清效價最高可達1.28×105，制備的三種重組蛋白抗血清均可與BPV全病毒抗原發(fā)生特異性反應，說明制備的抗血清均可識別BPV抗原，三個重組蛋白均具有良好的免疫原性。其中VP2-3(484～633aa)基因片段所表達的重組蛋白抗原性最好，表明分段表達并

8、純化的VP2蛋白具有病毒天然蛋白抗原反應活性。
　　 利用純化后的重組VP2-3蛋白作為包被抗原，建立了檢測BPV抗體的間接ELISA方法。通過試驗確定了最佳反應條件，抗原的最適包被濃度為20μ g/mL、血清最佳稀釋倍數(shù)為1:40、血清最適作用時間為1h、最適封閉液為2.5%脫脂乳、酶標抗體最佳稀釋倍數(shù)為1:5000、酶標抗體最適作用時間為1h、OPD-H2O2最佳顯色時間為10min。判定標準為OD490nm≥0.185者判

9、為抗體陽性，否則判為抗體陰性。包被的重組抗原不與牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛皰疹病毒(BHV)、牛副流感病毒3型(BPI3)和牛布魯氏菌病(B.abortus)的陽性血清發(fā)生交叉反應，表明建立的間接ELISA方法具有良好的特異性。批內(nèi)重復試驗和批間重復試驗變異系數(shù)均小于10%，表明該方法具有良好的重復性。該方法與血凝抑制試驗相比較，符合率為91.38%。用該方法對黑龍江省部分地區(qū)采集到的678份牛血清樣品進行檢測，結(jié)果有353份血清