藍(lán)舌病病毒1型衣殼蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、為了探究藍(lán)舌病(Bluetongue，BT)亞單位疫苗以及血清學(xué)檢測(cè)方法，本研究從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了探索:
　　1.培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞大量繁殖1型藍(lán)舌病病毒(BTV1)病毒液，利用蔗糖密度梯度離心從培養(yǎng)的病毒液中分離純化BTV1，將純化的BTV1滅活與弗氏完全佐劑混合乳化，免疫兔子和綿羊制備BTV多克隆抗體。
　　2.Trizol法從BTV1病毒液提取總RNA，設(shè)計(jì)引物RT-PCR克隆BTV1的四個(gè)衣殼蛋白VP2、VP3、

2、VP5、VP7基因，將克隆的目的基因插入pMD18-T載體，構(gòu)建克隆載體TVP2、TVP3、TVP5、 TVP7。
　　3.對(duì)克隆載體TVP2、TVP3、TVP5、TVP7和pFastBac HTB載體經(jīng)雙酶切，得到VP2、VP3、VP5、VP7基因和線性化的pFastBac HTB載體;再將四個(gè)衣殼蛋白基因插入線性化的pFastBac HTB載體，獲得重組轉(zhuǎn)座載體pVP2、pVP3、pVP5、pVP7;重組轉(zhuǎn)座載體轉(zhuǎn)化E.col

3、iDH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選獲得重組桿粒rVP2、rVP3、rVP5、rVP7;利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得重組桿狀病毒，用其感染Sf9細(xì)胞，分別通過(guò)SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況及其生物活性，進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)和純化。
　　4.利用表達(dá)的VP7重組蛋白，及前期制備的兔抗BTV多克隆抗體和綿羊抗BTV多克隆抗體，初步建立了藍(lán)舌病抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。
　　研究

4、結(jié)果顯示:
　　1.純化得到了BTV1，免疫動(dòng)物后獲得的多克隆抗體效價(jià)均在1∶1024以上
　　2.克隆的BTV1的四個(gè)衣殼蛋白VP2、VP3、VP5、VP7基因，大小依次為2886bp、2706bp、1581bp、1050 bp，與預(yù)期的結(jié)果相一致。
　　3.重組的桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞后，經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析，表達(dá)的四個(gè)蛋白的大小依次為115ku、107 ku、61 ku、38 ku，能