O型FMDV衣殼抗原的耐酸改造及其在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引發(fā)牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物易感染的一種動(dòng)物疫病，其傳播速度快、感染率高，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）列為必須上報(bào)的傳染病，被我國(guó)列為一類(lèi)動(dòng)物傳染病。接種疫苗是FMD防控最為有效的措施，在控制FMD暴發(fā)的過(guò)程中，F(xiàn)MD滅活疫苗

2、起到了極為重要的作用，但其在生產(chǎn)的過(guò)程中需要大量增殖FMDV強(qiáng)毒，存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)MDV空衣殼蛋白75S具有與完整FMDV146S粒子非常相似的抗原特性，可以引起與完整FMDV病毒粒子極其相似的免疫反應(yīng)，而且病毒空衣殼不含核酸成分，安全性好，不存在散毒風(fēng)險(xiǎn)。因此，研制FMDV空衣殼疫苗顯得極為重要。
　　為篩選與O型FMDV衣殼酸敏感性相關(guān)的位點(diǎn)，通過(guò)突變相關(guān)酸敏感性位點(diǎn)以提高衣殼蛋白在Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系

3、統(tǒng)(Bac-to-Bac baculovirus expression system)中的表達(dá)量，以研制出基因亞單位疫苗。本研究以牛源O型FMDV ON株為研究對(duì)象開(kāi)展耐酸性毒株的篩選工作，通過(guò)給予pH6.0酸性環(huán)境連續(xù)誘變，篩選獲得6株耐酸性毒株。將誘變病毒與親本病毒衣殼蛋白編碼區(qū)P1區(qū)序列比對(duì)后在6株耐酸毒株P(guān)1區(qū)發(fā)現(xiàn)6個(gè)6株共有的核苷酸突變，即存在于VP3上的錯(cuò)義突變A460C和G462A(K154Q)及存在于VP1上的錯(cuò)義突變A

4、121G(K41E)、A74G(Q25R)和A253G、A254C(N85A)。
　　然后以質(zhì)粒pMD19-P12A3C為模板，擴(kuò)增出編碼O型FMDV衣殼蛋白前體P12A及其蛋白酶3C的P12A3C基因，插入至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual PH啟動(dòng)子下，并做上述6個(gè)酸敏感性位點(diǎn)的突變，構(gòu)建出重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual-P12A3C，然后將其轉(zhuǎn)化DH10BacTM大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座子Bacmid-

5、P12A3C，將其轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得表達(dá)O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒rBac-P12A3C。用其感染Sf9細(xì)胞以增殖重組桿狀病毒，提取重組蛋白，然后通過(guò)間接免疫熒光、ELISA、western-blot檢測(cè)外源蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物能夠被O型FMDV多克隆抗體識(shí)別，并具有良好的反應(yīng)原性，表明表達(dá)O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒rBac-P12A3C構(gòu)建成功。將提取的蛋白樣品通過(guò)蔗糖密度梯度離心后用雙抗夾心ELISA檢測(cè)