鴨細胞因子克隆表達及ELISA檢測方法的建立.pdf

1、細胞因子是由細胞分泌的蛋白質，在炎癥和免疫應答中發(fā)揮著重要作用，主要參與激活和調節(jié)其他細胞和組織。目前對哺乳動物細胞因子研究較多，但對禽類細胞因子的作用以及它們相應的蛋白質研究甚少。原因是因為禽類與哺乳動物同源細胞因子的序列相似度很低。隨著禽類遺傳學和免疫學的新發(fā)現(xiàn)，研究者開始探索健康和疾病狀態(tài)中的細胞因子。櫻桃谷鴨作為禽類養(yǎng)殖的重要品種之一，對其細胞因子的研究較少，制約著對其免疫機制的深入研究;同時研究表明，在一些疾病的發(fā)生過程中，某

2、些細胞因子的水平會發(fā)生明顯的變化。因此，本研究對鴨IFN-γ、IL-2、TNF-α基因進行克隆，然后在原核表達系統(tǒng)中進行重組蛋白表達;以此為基礎，制備相應的單克隆抗體和多克隆抗體，并初步建立鴨IFN-γ抗原捕獲ELISA方法，為研究禽類細胞因子在免疫系統(tǒng)中的作用提供技術支持。
　　1、鴨IFN-γ、IL-2、TNF-α克隆、表達及蛋白純化
　　依據(jù)GenBank上發(fā)表的綠頭鴨IFN-γ基因序列、番鴨IL-2基因序列、雞TNF

3、-α基因序列分別設計特異性引物，提取櫻桃谷鴨脾臟淋巴細胞的總RNA，通過RT-PCR和3'RACE和5'RACE技術，成功擴增到鴨的IFN-γ、IL-2和TNF-α基因，對鴨的IFN-γ、IL-2和TNF-α基因進行測序，結果表明本研究通過RT-PCR技術擴增得到的櫻桃谷鴨IFN-γ、IL-2(去除信號肽部分)和TNF-α基因的ORF序列大小分別為495bp、363bp、447bp;利用3'RACE和5'RACE技術獲得的鴨TNF-α基

4、因序列全長為1049bp。序列分析表明，櫻桃谷鴨IFN-γ與綠頭鴨IFN-γ的編碼區(qū)核苷酸和氨基酸同源性分別為99.6％和98.8％，櫻桃谷鴨IL-2與番鴨IL-2的編碼區(qū)（去除信號肽部分）核苷酸和氨基酸同源性分別為98％和94％，櫻桃谷鴨TNF-α與雞TNF-α的編碼區(qū)核苷酸和氨基酸同源性分別為99.6％和100％。將鴨的IFN-γ、IL-2和TNF-α基因分別克隆至原核表達載體pCold TF DNA中，構建重組表達載體pCold-

5、DuIFNγ、pCold-DuIL2和pCold-DuTNFα，將構建的重組表達載體分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG低溫(15℃)誘導表達，表達的重組蛋白經(jīng)親和層析進行純化。SDS-PAGE檢測結果表明，這三個基因在大腸桿菌BL21(DE3)中均以可溶性方式獲得表達，融合蛋白相對分子質量分別約為70kDa、65kDa和68kDa。重組蛋白的成功表達、純化為單克隆抗體和多克隆抗體的制備奠定了基礎。
　　2、鴨IFN-γ、

6、IL-2、TNF-α的抗體制備
　　1)單克隆抗體制備:將純化的重組蛋白與佐劑等體積乳化，每隔兩周于皮下注射免疫BALB/c小鼠，并在融合前3天腹腔注射無佐劑的重組蛋白。通過間接ELISA篩選出血清效價最高的小鼠進行單抗制備，將小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經(jīng)HAT培養(yǎng)基和間接ELISA法篩選，并進行有限稀釋法亞克隆，獲得穩(wěn)定性分泌單克隆抗體，其中鴨IFN-γ單抗3株、IL-2單抗3株、TNF-α單抗3株。間接ELISA檢

7、測結果表明，所獲得的陽性雜交瘤細胞制備的小鼠腹水的效價在1∶25，600～1∶51，200之間。Western blot檢測結果表明，所獲得的單克隆抗體具有良好的反應原性。
　　2）多克隆抗體制備:每隔3周于皮下注射免疫新西蘭大白兔制備細胞因子抗血清，在最后一次免疫后14天收集兔血清，其效價在1∶12，800～1∶51，200之間。本研究成功制備了鴨IFN-γ、IL-2、TNF-α的單克隆抗體和多克隆抗體，為下步細胞因子檢測方法的

8、建立奠定了基礎。
　　3、鴨IFN-γ抗原捕獲ELISA檢測方法的建立
　　將鴨IFN-γ單克隆抗體作為捕獲抗體，鴨IFN-γ多克隆抗體作為檢測抗體，建立檢測鴨IFN-γ的抗原捕獲ELISA方法，通過對抗體濃度、封閉液等條件進行優(yōu)化，確定了單克隆抗體的最佳包被濃度為0.8μg/mL，多克隆抗體的最佳稀釋度為1∶2，000(濃度為0.8μg/mL)，最佳包被時間為4℃過夜，最佳封閉時間為1.5h，最佳封閉液為1％BSA溶液，最