藍(lán)舌病病毒群特異性構(gòu)象抗原表位的初步鑒定及競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)，屬呼腸孤病毒科、環(huán)狀病毒屬、藍(lán)舌病病毒亞群(Bluetongue virus subgroup)，該病是由庫(kù)蠓傳播的非接觸性反芻動(dòng)物病毒性傳染病，純種細(xì)毛羊?qū)υ摬∽顬槊舾?，死亡率高達(dá)35％，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類疫病，并且要求實(shí)時(shí)通報(bào)疫病，我國(guó)已將其規(guī)定為一類動(dòng)物傳染病。迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)BTV對(duì)人類有傳染性。
　　 BTV最早發(fā)現(xiàn)于1876年，呈世界性分布。

2、目前己從非洲、歐洲、亞洲、北美、南美和大洋洲的多個(gè)熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)國(guó)家分離到BTV，并且其分布范圍不斷擴(kuò)大，危害也日趨嚴(yán)重。我國(guó)于1979年發(fā)現(xiàn)本病存在，現(xiàn)已從全國(guó)29個(gè)省檢出BTV血清陽(yáng)性家畜。到目前為止，全世界共分離到26個(gè)血清型BTV，我國(guó)已鑒定出BTV-1、2、4、9、15、16、23等7個(gè)血清型，其中BTV-1和BTV-16是主要的致病血清型。
　　 BTV基因組大小約19Kb，由10個(gè)分節(jié)段的雙股RNA組成，編

3、碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP7)和5種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2，NS3，NS3a，NS4)。VP7蛋白由S7基因編碼，大小為349個(gè)氨基酸，位于病毒核衣殼的表面，約占病毒核心蛋白總量的36％。研究表明，各血清型BTVVP7蛋白94％以上的氨基酸保守，是BTV群特異性抗原蛋白。目前，國(guó)際上已經(jīng)開展了一些針對(duì)于藍(lán)舌病病毒VP7蛋白抗原表位鑒定的研究工作，但主要還是針對(duì)抗原線性表位的鑒定，對(duì)于VP7蛋白構(gòu)象表位的鑒定工作還沒有報(bào)道。Grim

4、es等人構(gòu)建的晶體結(jié)構(gòu)表明，VP7蛋白呈三聚體結(jié)構(gòu)，其中第134～253位氨基酸所構(gòu)成的晶體結(jié)構(gòu)位于VP7蛋白三聚體結(jié)構(gòu)的外表，是決定VP7蛋白抗原性的主要部位，也是與宿主細(xì)胞識(shí)別并吸附的主要部位。
　　 由于BTV血清型眾多，各血清型之間無交叉保護(hù)作用。在這種情況下，加強(qiáng)藍(lán)舌病病原學(xué)監(jiān)測(cè)工作，使用準(zhǔn)確的檢測(cè)手段對(duì)病原進(jìn)行檢測(cè)，及時(shí)隔離和處理已感動(dòng)物，是減少經(jīng)濟(jì)損失的關(guān)鍵。以具有群特異性阻斷效果的單克隆抗體(McAb)為基礎(chǔ)的競(jìng)

5、爭(zhēng)ELISA(C-ELISA)檢測(cè)待檢樣品中的BTV抗體，具有特異、敏感、穩(wěn)定和安全的特點(diǎn)，是OIE指定的血清學(xué)檢測(cè)方法之一，但由于進(jìn)口免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒價(jià)格昂貴，無法在畜牧業(yè)養(yǎng)殖業(yè)中推廣應(yīng)用，所以篩選制備具有BTV群特異性阻斷效果的McAb，自主研發(fā)C-ELISA檢測(cè)試劑盒，為我國(guó)BT的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)提供快速、安全及低成本的技術(shù)手段工作勢(shì)在必行。
　　 本研究利用BHK-21細(xì)胞對(duì)血清型12型BTV病毒進(jìn)行擴(kuò)繁，提取病毒RN

6、A，通過RT-PCR方法擴(kuò)增VP7基因，將擴(kuò)增后的VP7基因經(jīng)雙酶切后連接到原核表達(dá)載體pMAL-c4X上，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pMAL-c4X-VP7。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TB1感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)MBP-VP7融合蛋白后，利用樹脂對(duì)該蛋白進(jìn)行純化，Western blot和間接ELISA結(jié)果表明MBP-VP7蛋白具有良好的BTV群特異性免疫原性，并可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)于蛋白構(gòu)象表位的多克隆抗體。
　　 利用純化后的M

7、BP-VP7蛋白為免疫抗原，免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)將免疫后的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，以血清型12型BTV粒子作為篩選抗原，建立間接ELISA檢測(cè)方法，篩選分泌VP7蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，本研究最終獲得了5株能穩(wěn)定分泌針對(duì)VP7蛋白的McAb的雜交瘤細(xì)胞株，并將其分別命名為：BTV-1F3、BTV-2D10、BTV-2H10、BTV-4F11和BTV-4H7，這些抗體的獲得為BTV檢測(cè)方法的建立及抗原

8、表位鑒定提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 利用抗體亞類鑒定試劑盒對(duì)本研究篩選到的McAb進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，5株McAbs重鏈均為IgG1，輕鏈均為κ鏈。間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn)表明，單克隆抗體BTV-2D10和BTV-4H7可以與BTV24個(gè)血清型發(fā)生特異性反應(yīng)，而與茨城病病毒(IBAV)、中山病病毒(CV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛輪狀病毒(BRV)、牛腸道病毒(BE

9、V)、牛呼腸孤病毒(RV)及口蹄疫病毒(FMDV)不反應(yīng)，說明這兩株McAbs均為BTV群特異性單克隆抗體。
　　 競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)證明，BTV-4H7具有良好的BTV群特異性阻斷效果，所以本研究以MBP-VP7蛋白作為包被抗原、BTV-4H7作為競(jìng)爭(zhēng)抗體，建立了C-ELISA方法。利用該方法與IDEXX公司生產(chǎn)的BTV診斷試劑盒進(jìn)行比較，同時(shí)檢測(cè)15種不同血清型的BTV陽(yáng)性血清及322份采自廣西省不同地區(qū)的山羊血清樣品，兩者

10、的符合率分別為100%和98％，說明該方法可以用于BT的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)工作，該方法的建立為我國(guó)BTV抗體的監(jiān)測(cè)提供了安全、廉價(jià)、快速、準(zhǔn)確的技術(shù)手段。
　　 M13噬菌體展示結(jié)果表明，BTV-2D10及BTV-4H7所識(shí)別的B細(xì)胞表位均為構(gòu)象表位，其中BTV-2D10所識(shí)別的抗原表位至少由四個(gè)區(qū)域組成，它們分別是VP7蛋白的第185～186位、第205～207位、第236～240位和第278～279位氨基酸所在區(qū)域。具有BT

11、V群特異性阻斷效果的BTV-4H7所識(shí)別的抗原表位同樣至少由四個(gè)區(qū)域組成，它們分別是VP7蛋白的第34～35位、第175～177位、第185～186位和第278～279位氨基酸所在區(qū)域；利用生物信息學(xué)軟件Discovery Studio將M13噬菌體展示的這些氨基酸區(qū)域在Grimes等構(gòu)建的晶體結(jié)構(gòu)模型上進(jìn)行展示，同時(shí)利用DNAStar軟件對(duì)編碼不同血清型BTV VP7蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，利用M13噬菌體展示的這些氨

12、基酸區(qū)域在不同血清型BTV VP7蛋白的氨基酸序列上是非常保守的，結(jié)果同時(shí)表明BTV-2D10有兩個(gè)識(shí)別區(qū)域、BTV-4H7有三個(gè)識(shí)別區(qū)域位于VP7蛋白三聚體的LOOP結(jié)構(gòu)上，有研究表明LOOP結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的抗原性，易于刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，本研究所得到的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。通過軟件分析還發(fā)現(xiàn)BTV-2D10與BTV-4H7有兩個(gè)相同的氨基酸識(shí)別區(qū)域，證明不同的BTV群特異性McAb所識(shí)別的抗原表位在結(jié)構(gòu)上有差異，但在氨基酸序列上存在重疊的情

13、況。
　　 依據(jù)M13噬菌體展示出的構(gòu)象表位序列，本研究對(duì)具有藍(lán)舌病病毒群特異性阻斷效果的單克隆抗體BTV-4H7所識(shí)別的抗原表位所對(duì)應(yīng)的4個(gè)區(qū)域的16個(gè)氨基酸進(jìn)行了突變，突變時(shí)按照疏水性氨基酸向親水性氨基酸突變、親水型不帶電荷氨基酸與親水型帶正負(fù)電荷的氨基酸相互突變的原則，分別將第33～36位的LGIA突變成NSKT、第174～177位的IFQG突變成KKDS、第183～186位的MIYL突變成QKKN和第278～281位的W

14、HGL突變成KRSN，并將突變后的VP7蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，以表達(dá)后的蛋白為抗原、以本研究篩選到的McAb為抗體進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，鑒定突變后表達(dá)的VP7蛋白的抗原性及與BTV-4H7的反應(yīng)活性。SDS-PAGE結(jié)果表明，經(jīng)過氨基酸突變的VP7基因可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)大小與未突變的MBP-VP7蛋白大小相同；利用本研究篩選到的5株McAbs及IDEXX檢測(cè)試劑盒中的McAb對(duì)突變后的VP7蛋白進(jìn)行間接ELISA驗(yàn)證，結(jié)果

15、表明，突變后表達(dá)的VP7蛋白可以與本研究篩選到的4株McAbs發(fā)生特異性反應(yīng)，具有較好的抗原性，但卻不能與BTV-4H7及IDEXX檢測(cè)試劑盒中的McAb發(fā)生特異性反應(yīng)，證明M13噬菌體展示的單克隆抗體BTV-4H7所識(shí)別的4個(gè)區(qū)域的9個(gè)氨基酸序列是其所識(shí)別構(gòu)象抗原表位的關(guān)鍵氨基酸序列，同時(shí)突變后表達(dá)的VP7蛋白不能與IDEXX檢測(cè)試劑盒中的McAb發(fā)生特異性反應(yīng)，這證明在VP7蛋白的氨基酸序列上，具有藍(lán)舌病病毒群特異性阻斷功能的核心氨