病毒性軟化病病原（桐鄉(xiāng)株）的分離鑒定及ELISA檢測方法的初步應用.pdf

1、家蠶病毒性軟化病是家蠶四種病毒病之一，對蠶業(yè)生產(chǎn)造成非常嚴重損失的病害。日本學者Yamazaki等在1960年最早報道家蠶軟化病毒，其后該病毒在日本得到廣泛的研究。Ayuzawa(1972)首次應用超速離心法從家蠶獲得該病的病原一家蠶病毒性軟化病病毒(Bombyx mori infectious flacherie virus，BmIFV)。Kawase等(1980)研究表明該病毒(家蠶軟化病坂城株病毒)為細小核糖核酸病毒(picoma

2、virus)科病毒。Isawa等(1998)測定了坂城株BmIFV的全基因組序列，對核苷酸序列的比較(2C、3C和3D等)表明該病毒類似于哺乳動物和植物的細小核糖核酸病毒，但對其基因組結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進化的推測研究表明該病毒與昆蟲和植物的細小核糖核酸病毒有進化關(guān)系，因此將其定為類似細小核糖核酸病毒。我國是世界上最大的養(yǎng)蠶國，即具有BmIFV最大的可寄生群體，但有關(guān)該病毒的分離研究、在我國蠶桑地區(qū)的流行狀況，以及危害程度等至今未見報導。本文對從

3、中國浙江桐鄉(xiāng)蠶區(qū)分離的一株疑似家蠶病毒性軟化病病毒的非包含體病毒進行了研究。 從浙江桐鄉(xiāng)收集的具有典型家蠶軟化病癥的病蠶，解剖取中腸，加磷酸鹽緩沖液(pH=7.2)破碎勻漿。用氯仿抽提去除雜蛋白，40％硫酸銨(25℃)飽和度溶液鹽析，10700 r/min離心30 min(4℃)去除雜質(zhì)，蔗糖密度梯度超速離心(40％、30％、20％、10％的梯度，55000×g，2 h)，紫外分光光度計檢測吸收峰特征，電子顯微鏡下觀察，病毒為非

4、包涵體無囊膜，大小約為26nm的球形粒子。 從分離純化的病毒粒子提取病毒核酸，核酸的地衣酚反應呈陽性，二苯胺反應為陰性。將病毒核酸分別用DNase I和RNase A降解，經(jīng)甲醛變性凝膠電泳分析病毒核酸能為RNase降解，而不被DNase降解，實驗表明病毒核酸為RNA。分離純化的病毒，經(jīng)12％的分離膠SDS電泳分析，可見該病毒有4個主要蛋白及3個次要蛋白條帶與已發(fā)表的BmIFV 相似，但未見VP4。 利用雜交瘤技術(shù)獲得了

5、2株分泌抗家蠶軟化病毒抗體的細胞株4E12、3G3，并對他們所分泌的單克隆抗體做了初步的鑒定。用辛酸一硫酸銨方法純化的單克隆抗體4E12和3G3的腹水蛋白質(zhì)濃度分別為：2.252 mg/ml和2.438mg/ml；抗體類型及亞類鑒定結(jié)果表明，4E12和3G3的抗體類型及亞類均為IgGl；2株單克隆抗體腹水的間接ELISA效價均達10<'-6>以上。FAS-ELISA測定表明，2株單抗僅對BmIFV有特異性反應，而與家蠶濃核病毒(BmDN

6、V)無特異性反應。用Western blotting對2株細胞分泌的單抗鑒定，表明它們的靶蛋白都是BmIFV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1(35kD)。利用制備的單抗建立了抗原包被的間接ELISA檢測BmIFV方法，對浙江省桐鄉(xiāng)蠶區(qū)的病蠶樣本檢測表明，該病在該區(qū)感染流行較為普遍。 本文首次從中國浙江省桐鄉(xiāng)市蠶區(qū)分離和初步鑒定了一株家蠶病毒性軟化病病毒(BmIFV-CHNool)，建立了基于免疫學的檢測方法，并對該病毒引起的病害流行狀態(tài)作了初步