禽用病毒性活疫苗中雞傳染性貧血病毒檢測方法的研究及其應(yīng)用.pdf

1、應(yīng)用CIAV的標準毒株，通過不同的培養(yǎng)方法進行病毒繁殖，測定病毒含量，并利用濃縮技術(shù)對細胞毒進行了濃縮，使用1日齡SPF雞進行了致病性試驗。結(jié)果表明，CIAV可經(jīng)MDCC-MSBl細胞或雞胚或1日齡雞三種方法繁殖，以細胞繁殖的病毒含量最高，經(jīng)濃縮后，病毒含量可以達到106.4TCID50／0．1ml。致病性試驗表明，CIAV引起胸腺萎縮、骨髓黃化和血液稀薄等臨床病變。 根據(jù)Genbank上發(fā)表的CIAV基因全序列，將Cux一1株

2、、Gifu-1株和China株進行基因序列比較，根據(jù)保守區(qū)的序列，設(shè)計合成一對特異性引物，按標準反應(yīng)體系裝配反應(yīng)，應(yīng)用梯度PCR選擇引物最佳的退火溫度為59℃，經(jīng)試驗選擇最佳的鎂離子濃度為1．5mM，并對其它的反應(yīng)條件進行了優(yōu)化。該對引物與MDV、POX、ILTV等DNA病毒和正常細胞DNA沒有交叉反應(yīng)，使用CIAVCux～l株、Gifu-1株和TK5803株感染的細胞、雞胚組織提取的DNA作為模板進行PCR擴增，均可以擴增出特異條帶。

3、使用不同含量的DNA為模板進行PCR擴增，結(jié)果表明DNA含量在1Opg／ul以上和病毒含量在10-1.6TCID50。以上時，可以擴增到特異性條帶。將PCR產(chǎn)物純化后與pGEM—Teasy載體連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，經(jīng)含Amp的培養(yǎng)基進行藍、白斑篩選，成功地篩選出陽性重組子。利用質(zhì)粒PCR擴增法鑒定陽性重組子，證實了重組的正確性。取陽性質(zhì)粒DNA進行序列測定分析，結(jié)果表明所獲得的克隆序列與三株病毒的相應(yīng)序列之間的同源性

4、分別為98．6％，98．2％和94．6％。 使用濃縮的肝臟組織毒免疫SPF雞制備高免血清，經(jīng)硫酸銨沉淀后提取IgG，建立了檢測CIAV的間接免疫熒光試驗。將接毒細胞離心后制成細胞涂片，對購入的異硫氰酸標記的羊抗雞IgG和提取的抗CIAVIgG工作濃度進行標定，結(jié)果表明提取的抗CIAVlgG作1：40稀釋，熒光二抗作1：1000稀釋，可以檢測到病毒感染細胞特異的顆粒狀熒光。敏感性試驗證明，最低可以檢測到100.4TCID50病毒感