馬傳染性貧血病毒p26蛋白抗原表位鑒定與AC-ELISA方法的建立.pdf

1、馬傳染性貧血（Equine infectious anemia，EIA）是一種能夠感染馬、驢和斑馬等馬屬動(dòng)物的動(dòng)物性傳染病。它能夠引起馬屬動(dòng)物貧血、血小板減少、發(fā)熱、消瘦和多器官衰竭等癥狀。EIA由Ligné于1843年在法國首次發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已在美洲、歐洲、中東和南非等世界范圍都有流行，使當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)，賽馬業(yè)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失。解放前期，我國也曾出現(xiàn)EIA流行，但在20世紀(jì)70-80年代由于沈榮顯等人研制出EIAV弱毒疫苗，從而使疫病

2、得到有效控制。
　　馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV)是引起EIA的病原體。EIAV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒，同其他慢病毒如人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)、猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）和貓免疫缺陷病毒(Felineimmunodeficiency virus)類似，EI

3、AV包含有Gag、Pol和Env3個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白和Tat、Rev和S23個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。Gag蛋白作為多聚蛋白，最終可以剪切為基質(zhì)蛋白(MA)、衣殼蛋白(CA)、核衣殼蛋白(NC)和p9蛋白，這些蛋白都作為病毒粒子結(jié)構(gòu)的一部分而存在。
　　EIAV衣殼蛋白又稱為p26蛋白，它的主要功能是自我組裝形成病毒的衣殼結(jié)構(gòu)，其構(gòu)成的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)包裹EIAV的基因組以確保病毒的有效復(fù)制。同時(shí)作為病毒感染過程中的主要免疫原性蛋白，p26在不同EI

4、AV株的結(jié)構(gòu)與功能高度保守。并且p26蛋白也是病毒粒子中豐度最高的蛋白之一。
　　本研究通過實(shí)驗(yàn)室制備的2株EIAVp26單克隆抗體:MAb1G11和MAb9H8，利用肽掃描技術(shù)，最終通過免疫印跡試驗(yàn)(western blot)鑒定出MAb1G11和MAb9H8所針對(duì)p26蛋白的線性表位。MAb1G11針對(duì)p26蛋白C端的20個(gè)氨基酸:199KNAMRHLRPEDTLEEKMYAC218;MAb9H8則針對(duì)N端的8個(gè)氨基酸:73N

5、LDKIAEE80。這對(duì)于分析p26蛋白結(jié)構(gòu)與功能以及以表位為基礎(chǔ)建立診斷方法提供了依據(jù)，也對(duì)基于表位的疫苗設(shè)計(jì)具有指導(dǎo)意義。
　　在國務(wù)院頒布的《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012-2020年）》中，明確指出要對(duì)EIA開展持續(xù)監(jiān)測，對(duì)經(jīng)濟(jì)娛樂用馬以及高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域的馬屬動(dòng)物進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測，從而加快推進(jìn)馬傳染性貧血消滅行動(dòng)。根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際和國家發(fā)展綱要，建立快速有效的診斷EIA的方法顯得尤為迫切與重要。傳統(tǒng)檢測EIAV的方法是利用p26

6、蛋白檢測EIAV抗體的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Agar gelimmunodiffusion，AGID)，又稱為Coggins試驗(yàn)。盡管AGID在檢測EIAV高度特異，但是缺乏敏感性。這對(duì)于檢測處于慢性期和非明顯期的臨床癥狀的EIA感染尤為不利。同時(shí)只能通過肉眼觀察抗原抗體結(jié)合的沉淀線粗細(xì)來對(duì)EIAV含量進(jìn)行粗略判斷，并無法對(duì)病毒進(jìn)行定量分析。再次，由于試驗(yàn)周期較長，無法對(duì)疾病進(jìn)行快速診斷，使得在生產(chǎn)實(shí)踐無法對(duì)疫情做到及時(shí)有效防控。
　　本

7、研究所鑒定的線性表位分別針對(duì)p26蛋白的N端與C端。其所針對(duì)的差異表位特性，為本實(shí)驗(yàn)建立抗原捕獲ELISA(Antigen Capture-ELISA，AC-ELISA)提供了可能。因此通過利用EIAV(CMV3-8)感染性克隆或重組p26蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，以MAb1G11和MAb9H8分別作為捕獲抗體和酶標(biāo)檢測抗體，建立以檢測EIAV的AC-ELISA方法。該方法也可以對(duì)病毒進(jìn)行定量，這也為研究病毒復(fù)制與其他相關(guān)生活周期病毒含量變化，

8、以及EIAV與宿主限制因子(host restrictionfactors)如TRIM5α，APOBEC3家族和Tetherin相互拮抗作用提供了定量分析平臺(tái)。
　　綜上，本研究利用針對(duì)EIAV p26蛋白的兩株單克隆抗體MAb1G11和MAb9H8，利用肽掃描技術(shù)鑒定出p26蛋白在蛋白N端與C端的線性表位;同時(shí)利用MAb1G11和MAb9H8識(shí)別p26蛋白表位的差異性，建立針對(duì)不同EIAV病毒株的AC-ELISA方法。已鑒定的線