馬傳染性貧血病毒受體選擇剪接變異體的鑒定及功能性研究.pdf

1、病毒特異性的細胞受體是病毒入侵細胞的門戶，決定病毒的宿主范圍、組織及細胞嗜性。從受體角度闡明病毒入侵機制，是病毒性疾病的藥物研發(fā)及疫苗研制的重要方面。選擇性剪接可使同一基因編碼出功能不同蛋白，選擇性剪接對滿足生物體復雜性所需蛋白多樣性具有重要意義。鑒定不同選擇性剪接變異體的功能已成為生物學界研究的熱點。 馬傳染性貧血病毒(Equine infectiors anemia virus，EIAV)受體(ELRl)是2005年Zhan

2、g等通過克隆表達技術發(fā)現(xiàn)的，其屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)蛋白家族，本研究在原代培養(yǎng)的馬的單核巨噬細胞上克隆ELR1的過程中，發(fā)現(xiàn)其mRNA基因序列存在選擇性剪接形式，即其cDNA序列除所報導的序列ELRl外，還存在插入序列ELRl-IN和缺失序列ELR1-DE，ELRl-IN在已公布的序列的786-787位之間插入153bp，ELR1-DE型序列缺失了所公布序列415-478位64bp。不論序列的插入還是缺失均導致編碼框的移位，而

3、產(chǎn)生截短的受體多肽片段。 為定量各種形式受體在體內的表達比率，本研究建立了可以特異性檢測各種形式受體表達比率的SYBR Green　eal-time　RT-PCR方法。該方法通過在不同的位置設計引物來分別定量三種形式剪接體(ELR1+ELR1-IN+ELR1-DE)、兩種形式剪接體(ELR1+ELR1-IN)及插入型剪接體(ELR1-IN)的拷貝數(shù)，通過運算就可以定量出每種剪接體的拷貝數(shù)并確定它們之間的表達比率。同時為減少實驗誤

4、差，本研究僅采用插入型序列質粒來構建標準品，每對引物均應用這個標準品來定量各自所擴增基因的拷貝數(shù)，這樣就減少了標準品之間差異所造成的誤差。并通過比較了三對不同引物擴增同一標準品的符合程度確定這種方法可行。應用這種方法定量出每種形式受體的表達比率為ELRl-IN:ELRl-DE:ELRl=3:1.7:1。 為確定各種形式選擇性剪接變異體的蛋白表達形式，本研究將每種剪接變異體序列均連接到真核表達載體pcDNA3.1(+)上，構建成真

5、核表達質粒，轉染入293細胞和Hela細胞.通過間接免疫熒光和Western-blot證明各種形式受體均可表達，膜結合型受體ELRl表達蛋白49ku，且均表達在細胞膜上，插入型受體ELRl-IN表達蛋白大小在38ku左右，以可溶性形式表達，缺失型序列ELRl-DE可以以第二個編碼區(qū)編碼蛋白，表達蛋白大小在36ku左右，表達在細胞膜上。 為研究可溶性受體的功能，本研究分別構建了穩(wěn)定表達膜結合型受體和穩(wěn)定表達插入型受體的293細胞系

6、，分別命名為293-ELRl和293-ELRl-IN，通過real-timeRT-PCR和RT酶活性檢測，結果表明393-ELR1細胞系可以支持EIAV的驢胎皮膚細胞弱毒FDDV毒株的進入及復制，而對于293-ELR1-IN細胞系，推測僅可以支持病毒的進入，并不能支持病毒的復制。將插入型序列的真核表達質粒轉染293-ELRl細胞并以真核表達載體pcDNA3.1(+)及未轉染的空白293-ELR1細胞為陰性對照，轉染后接種FDDV毒株并應

7、用RT酶活性檢測病毒活性，結果表明轉染插入型序列質粒的受體組病毒活性明顯低于轉染真核表達載體pcDNA3.1(+)及未轉染的空白293-ELR1細胞中病毒的活性，說明插入型序列表達的可溶性受體可以明顯抑制FDDV毒株的感染表達膜結合型病毒受體的細胞系。 為進一步研究病毒與受體相互作用的機制，針對病毒受體的特異性抗體是后期實驗所必需的，故本實驗又構建了ELR1基因的完整編碼區(qū)及胞內區(qū)的原核表達體系，并實現(xiàn)了其在大腸桿菌中的表達，為