酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)馬傳染性貧血病毒核衣殼蛋白的聚合.pdf

1、一些蛋白質(zhì)合成出來(lái)即具有生物學(xué)活性，但對(duì)于另一些蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，翻譯完成后要經(jīng)過(guò)不同方式的加工修飾才能成為活性形式，二聚化或多聚化就是其中常見(jiàn)的加工方式。研究蛋白質(zhì)聚合的常用方法有凝膠過(guò)濾層析法、非變性凝膠電泳法和動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)等。此外，研究蛋白-蛋白相互作用的方法，如酵母雙雜交、免疫共沉淀、pull down等，也可以用來(lái)鑒定蛋白質(zhì)的聚合。這些方法應(yīng)用廣泛，各有利弊。馬傳染性貧血病毒(equine infectious anemia vi

2、rus，EIAV)與人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)同屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬，是研究HIV的理想模型。EIAV的核衣殼蛋白(nucleocapsid，NC)能與病毒基因組結(jié)合，形成核酸-蛋白復(fù)合體，在病毒生活周期的各個(gè)階段發(fā)揮重要作用。核衣殼蛋白具有典型的CCHC型鋅指結(jié)構(gòu)，具有這種結(jié)構(gòu)的蛋白易于發(fā)生同源或異源聚合。
　　 本文對(duì)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked im

3、munosorbent assay，ELISA)進(jìn)行了改良，并將之應(yīng)用于檢測(cè)馬傳染性貧血病毒核衣殼蛋白的聚合。首先構(gòu)建了不帶FLAG標(biāo)簽的和N-端或C-端融合有FLAG標(biāo)簽的NC原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-H-nc、pET28a-HF-nc和pET28a-H-nc-F，利用親和層析的方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行了純化，得到了純度較高的蛋白。然后將改良的酶聯(lián)免疫吸附法用于檢測(cè)NC的聚合：將NC包被于多孔板底，用帶FLAG標(biāo)簽的NC與之結(jié)合，然后依次加

4、入抗-FLAG的單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗以及HRP的底物，終止反應(yīng)后于450 nm波長(zhǎng)下讀取吸收值以檢測(cè)蛋白是否發(fā)生聚合。
　　 本文還對(duì)NC聚合的特異性、劑量依賴效應(yīng)和影響因素等進(jìn)行了評(píng)價(jià)。利用改良的酶聯(lián)免疫吸附法，我們檢測(cè)到馬傳染性貧血病毒的NC可發(fā)生特異性聚合，且聚合程度在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，此外，我們還發(fā)現(xiàn)核酸能夠影響NC的聚合，而FLAG標(biāo)簽的位置則對(duì)聚合沒(méi)有影響。這些結(jié)果為研究NC與核酸的相互作用