抗血小板膜糖蛋白基因工程抗體的制備和性質(zhì)研究.pdf

1、蘇州大學(xué)博士學(xué)位論文抗血小板膜糖蛋白基因工程抗體的制備和性質(zhì)研究姓名：安廣宇申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科血液學(xué)指導(dǎo)教師：阮長(zhǎng)耿2001.4.1墊坐!：堡墮焦墨宴莖里三堡墊竺墮型魚(yú)塑絲墮堡壅一——塑——墨一BL2lrDE3)PlysS中表達(dá)了功能分子。SDS—PAGE和Westernblot顯示表達(dá)產(chǎn)物的分子量為27000。該融合蛋白除少量為分泌型表達(dá)外，主要以包涵體形式存在，表達(dá)量占菌體總蛋白的21％，約20mg／L。同時(shí)探索了該抗體片

2、段的最佳復(fù)性條件。把包涵體形式表達(dá)的Sz2l單鏈抗體片段用尿素溶解，經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)的體外重折疊復(fù)性過(guò)程，成功地得到具有活性的單鏈抗體片段。ELISA和Western印跡檢測(cè)證實(shí)，該墮鏈抗體保留了與血小板特異結(jié)合的能力。四SZ21SeFv的純化和體外性質(zhì)研究通過(guò)NiNTA樹(shù)脂親和吸附純化，獲得具有活性的高純度單鏈抗體片段，純度達(dá)95％以上。流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)該單鏈抗體能與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和血小板反應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)表明，Sz21單鏈抗體能夠抑制AD

3、P誘導(dǎo)的血小板聚集，其抑制能力呈劑量依賴性，其IC。為12ug／mL在濃度為20ug／mL時(shí)達(dá)到最大抑制率。對(duì)花生四稀酸誘導(dǎo)的血小板聚集亦有相似的抑制作用。此外，SZ21單鏈抗體同樣能夠抑制纖維蛋白原與血小板的結(jié)合，顯示了其抗血栓作用。以上結(jié)果表明，制備的基因工程抗體具有原鼠單克隆抗體的抗血栓形成能力，減少了全抗體的人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)；同時(shí)該小分子抗體片段去除了抗體的Fc段，避免鼠源性單克隆抗體引起血小板嚴(yán)重下降的副作用。該單鏈

4、抗體有望用于抗血栓治療。五抗血小板膜糖蛋白單抗sz21嵌合Fab片段基因構(gòu)建和表達(dá)研究利用基因克隆技術(shù)，從雜交瘤細(xì)胞系SZ21中克隆出輕、重鏈可變區(qū)基因，然后亞克隆到含有人恒區(qū)基因CⅢ和C。的質(zhì)粒pSWlFab中，構(gòu)建成人一鼠嵌合Fab抗體片段質(zhì)粒pSZ21，在大腸桿菌中表達(dá)了可溶性Fab抗體片段。SDSPAGE顯示在分子量(脅)45000處有一誘導(dǎo)條帶，與該嵌合抗體的理論計(jì)算值相符。表達(dá)量約為800ug／L，ELISA和Western