抗血小板膜糖蛋白Ibα單克隆抗體的人源化及基于膜糖蛋白Ibα結(jié)構(gòu)的活性小分子化合物研究.pdf

1、第一部分抗血小板膜糖蛋白Ib單克隆抗體的人源化研究
　　 研究背景：血小板膜糖蛋白(GP)Iba是血小板特異性的跨膜糖蛋白，高剪切力條件下在血管性血友病因子(VWF)的介導(dǎo)下與血管損傷部位暴露的膠原結(jié)合，起始血小板的黏附，進而引起血小板聚集。GPIba與VWF結(jié)合引起的血小板黏附是動脈血栓形成的關(guān)鍵步驟。
　　 目的：研制人鼠嵌合抗GPIba單克隆抗體，阻斷VWF與GPIba的結(jié)合，為開發(fā)新型抗血小板藥物提供基礎(chǔ)。

2、>　　 方法和結(jié)果：采用5’快速擴增cDNA末端(RACE)的方法從分泌鼠源抗人血小板膜糖蛋白GPIba單克隆抗體(SZ2)的雜交瘤細(xì)胞中分別擴增重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列和信號肽序列，裝入克隆載體后測序，經(jīng)IMGT網(wǎng)站序列比對，確認(rèn)是抗體序列后設(shè)計引物，PCR擴增后分別將重鏈和輕鏈可變區(qū)序列連同信號肽序列克隆入含有人免疫球蛋白重鏈Y鏈和輕鏈kappa恒定區(qū)的帶有巨細(xì)胞病毒啟動子的真核表達載體中。將兩個表達載體共轉(zhuǎn)染二氫葉酸還原酶缺陷的中

3、國倉鼠卵巢(CHO-dhfr/)細(xì)胞后，在氨甲喋呤逐步加壓下擴增抗體基因，篩選抗體高表達細(xì)胞克隆。用ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中嵌合抗體重鏈及輕鏈的表達。我們篩選到一株高表達克隆，即3G09，1×106細(xì)胞24小時的表達量可達2.5μg。Westernblot方法檢測到非還原條件下150kDa的完整抗體條帶，還原條件下50kDa和25kDa的分別代表重鏈和輕鏈的條帶。收集培養(yǎng)上清后用蛋白A柱純化，純化后的嵌合抗體經(jīng)SDS-PAGE分

4、離后考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果同樣顯示非還原條件下150kDa的完整抗體條帶和還原條件下50kDa和25kDa的條帶，且純度在95％以上。流式細(xì)胞術(shù)檢測純化的嵌合抗體能與表達GPIb的CHO細(xì)胞結(jié)合。純化后的抗體用木瓜蛋白酶處理，酶切產(chǎn)物用蛋白A柱處理以去除未酶切完全的完整抗體和Fc片段，收集Fab片段后經(jīng)SDS-PAGE分離后考馬斯亮藍(lán)染色，檢測Fab純度在90％以上。血小板聚集試驗發(fā)現(xiàn)嵌合SZ2Fab能夠抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集，且

5、抑制效果呈劑量依賴性。此外，嵌合SZ2Fab在10μg/ml派度下抑制流動小室中血小板在固定化的VWF上的黏附。
　　 結(jié)論：構(gòu)建了人-鼠嵌合抗體的表達載體并在CHO細(xì)胞中成功的進行了嵌合抗體的表達；嵌合Fab片段具有潛力開發(fā)成預(yù)防和治療動脈血栓的新型抗體藥物。
　　 第二部分基于血小板膜糖蛋白Iba結(jié)構(gòu)的活性小分子化合物研究
　　 研究背景：血漿VWF結(jié)合血小板GPIba是高剪切力狀態(tài)下血小板黏附的起始步驟，通

6、過GPIb的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致血小板aⅡbβ3整合素的活化。
　　 目的：篩選抑制VWF與GPIba相互作用的小分子化合物。
　　 方法和結(jié)果：我們采用虛擬篩選的方法用DOCK4.0軟件將SPECS化合物庫中的所有小分子化合物對接到GPlbα中的VWF結(jié)合區(qū)，選取打分前149位的小分子進行實驗分析，具有抑制VWF結(jié)合GPIba的小分子進一步做血小板功能的生物活性測試。我們發(fā)現(xiàn)其中一個化合物YC148具有抑制血漿VWF結(jié)合

7、重組的GPlbaN端片段與免疫球蛋白Fc段融合蛋白的作用，但是有意思的是，該化合物不抑制瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集，相反，YC148本身可誘導(dǎo)人血小板聚集，而不依賴外源性誘導(dǎo)劑如瑞斯托霉素和博托霉素的存在。YC148也可誘導(dǎo)洗滌血小板的聚集。流式細(xì)胞術(shù)顯示YC148可誘導(dǎo)血小板膜表面P-選擇素的表達及增強單克隆抗體PAC-1結(jié)合血小板的能力。YC148誘導(dǎo)的血小板聚集作用可被抗血小板GPIba單克隆抗體6D1部分抑制。此外，缺乏GPlb