量子點(diǎn)流式微球技術(shù)定量檢測(cè)半乳甘露聚糖方法學(xué)建立及初步臨床應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　以曲霉菌細(xì)胞壁特殊成分—半乳甘露聚糖（Galactomannan，GM）作為研究對(duì)象，構(gòu)建一種便捷、靈敏度高、特異性高、可定量測(cè)定曲霉菌半乳甘露聚糖的檢測(cè)方法。
　　方法:
　　1.光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞儀對(duì)聚苯乙烯微球進(jìn)行初步觀察。
　　2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)聚苯乙烯微球偶聯(lián)抗體能力。
　　3.共價(jià)偶聯(lián)法制備生物素化抗體。
　　4.EDAC偶聯(lián)法制備鏈霉親和素化量子點(diǎn)(QDs

2、-SA)。
　　5.聚苯乙烯微球與抗體采用EDAC偶聯(lián)法進(jìn)行偶聯(lián)，微量BCA蛋白質(zhì)定量法觀察免疫診斷微球穩(wěn)定性。
　　6.量子點(diǎn)流式微球技術(shù)定量檢測(cè)血清半乳甘露聚糖方法學(xué)建立，對(duì)其精密度、線性范圍、靈敏度、回收率、干擾率、方法學(xué)比對(duì)等進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　　7.量子點(diǎn)流式微球技術(shù)定量檢測(cè)半乳甘露聚糖方法、國(guó)外Platelia Aspergillus試劑盒和國(guó)內(nèi)半乳甘露聚糖ELISA試劑盒對(duì)臨床血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)方法診

3、斷效能進(jìn)行受試者工作曲線（ROC）分析。
　　8.量子點(diǎn)流式微球技術(shù)定量檢測(cè)半乳甘露聚糖方法對(duì)臨床血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè);western blot法和全自動(dòng)免疫熒光定量分析儀mini-VIDAS對(duì)臨床血清標(biāo)本進(jìn)行降鈣素原檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.2μm、5μm、10μm聚苯乙烯微球形態(tài)規(guī)則圓潤(rùn)、粒徑均一性好、無(wú)畸形球、無(wú)微球碎片、微球分布均勻、無(wú)粘黏現(xiàn)象，微球表面孔穴豐富。
　　2.羧基化聚苯乙烯微球偶聯(lián)抗體能力顯著

4、強(qiáng)于未羧基化聚苯乙烯微球，共價(jià)偶聯(lián)的抗體生物活性未受明顯影響。
　　3.成功制備鏈霉親和素化量子點(diǎn)與生物素化抗體，生物素化抗體生物活性未受到明顯影響，與鏈霉親和素化量子點(diǎn)可發(fā)生特異性結(jié)合。
　　4.鼠抗半乳甘露聚糖抗體最佳偶聯(lián)濃度為100μg/mL;鏈霉親和素化量子點(diǎn)最佳使用濃度為20nmol/L;生物素化抗體最佳使用濃度為8μg/L;最佳偶聯(lián)時(shí)間為2h;免疫診斷微球儲(chǔ)存于4℃環(huán)境中可維持65d穩(wěn)定性。
　　5.量子點(diǎn)

5、流式微球技術(shù)定量檢測(cè)半乳甘露聚糖方法線性范圍、靈敏度、變異系數(shù)優(yōu)于國(guó)內(nèi)半乳甘露聚糖ELISA試劑盒;本方法回收率為97.57％-104.96％，總平均回收率為100.76％;50μg/mL-200μg/mL膽紅素對(duì)本方法檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響;兩種方法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性較好。
　　6.量子點(diǎn)流式微球技術(shù)定量檢測(cè)半乳甘露聚糖方法診斷效能優(yōu)于國(guó)內(nèi)半乳甘露聚糖ELISA試劑盒;本方法與國(guó)際公認(rèn)商品化Platelia Aspergillus試劑盒

6、診斷效能相近;兩種方法檢測(cè)半乳甘露聚糖陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異。
　　7.侵襲性曲霉菌感染組血清半乳甘露聚糖水平較正常對(duì)照組、膿毒血癥組顯著升高。
　　8.侵襲性曲霉菌感染組血清降鈣素原水平、陽(yáng)性檢出率顯著高于正常對(duì)照組，低于膿毒血癥組，侵襲性曲霉菌感染組降鈣素原陽(yáng)性檢出率明顯低于半乳甘露聚糖陽(yáng)性檢出率。
　　結(jié)論:
　　1.成功制備生物素化抗體和鏈霉親和素化量子點(diǎn)，抗體生物活性未受明顯影響。
　　2.免疫診斷微

7、球穩(wěn)定性較好，基本符合臨床需要。
　　3.成功創(chuàng)建量子點(diǎn)流式微球技術(shù)定量檢測(cè)半乳甘露聚糖方法，方法學(xué)評(píng)價(jià)良好，符合國(guó)際要求，優(yōu)于國(guó)內(nèi)ELISA試劑盒;檢測(cè)結(jié)果與國(guó)內(nèi)半乳甘露聚糖ELISA試劑盒相關(guān)性較好。
　　4.本方法與國(guó)外Platelia Aspergillus試劑盒診斷效能相近，診斷效能優(yōu)于國(guó)內(nèi)ELISA試劑盒，具有良好的臨床適用性。
　　5.侵襲性曲霉菌感染患者血清降鈣素原水平顯著高于正常體檢者，可進(jìn)一步拓展降