高通量測序技術(shù)在急性髓系白血病臨床檢測中的方法學(xué)建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　急性髓細胞白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是一組高度異質(zhì)的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。細胞遺傳學(xué)異常是AML疾病診斷、評價預(yù)后和治療方案的選擇中最重要的獨立預(yù)后指標之一。
　　Thermo Life公司基于其多年做PCR的經(jīng)驗，推出了AmpliSeq建庫方案，該專利技術(shù)以多重PCR為反應(yīng)基礎(chǔ)，同時又突破了以往多重PCR的已知障礙，僅利用少量的起始DNA，就可以實現(xiàn)成千上萬個目標基因的擴增能夠在

2、單管多重PCR反應(yīng)內(nèi)完成。新設(shè)計的試劑盒一方面盡可能的囊括目前有臨床指導(dǎo)意義的基因，另一方面，也希望能發(fā)現(xiàn)一些新的位點異常。本課題第一部分的目的在于研究Ion Torrent PGMTM測序平臺及自制的AML CancerPanel在AML臨床診斷中的方法學(xué)建立。
　　伴有t(8;21)(q22;q22)遺傳學(xué)異常的AML是較常見的一類AML，約占成人AML的10％-15％，90％的t(8;21)易位發(fā)生在FAB分型AML-M2中

3、，其余見于M0、M1、M4及骨髓增生異常綜合征(MDS)和治療相關(guān)性AML中，伴有這類染色體易位的AML通常被認為預(yù)后較好，特別是高劑量阿糖胞苷作為強化鞏固治療手段后，但此類AML異質(zhì)性較大，仍然有30-50％的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)并對化療藥物耐藥。提示了一些患者可能伴有不良的分子事件，并暗示我們需要尋找新的提示預(yù)后的標記并據(jù)此來調(diào)整治療方案。以往研究基因突變的傳統(tǒng)方法Sanger測序因技術(shù)本身的局限性，使其在研究基因突變譜時受到了很大的限制，

4、因此對t(8;21)AML細胞基因突變研究往往集中在有限的目標基因中。更鮮有報道從大范圍目標基因水平上來比較t(8;21) AML初發(fā)和復(fù)發(fā)時的基因突變譜變化。本課題第二部分利用新建立的Ion TorrentPGMTM測序平臺，對t(8;21) AML患者初發(fā)和復(fù)發(fā)時自身配對骨髓標本的基因突變情況進行檢測，以期從分子生物學(xué)角度分析t(8;21)AML患者初發(fā)和復(fù)發(fā)時的克隆演化情況，為該類患者選擇合適的再治療措施提供依據(jù)。
　　方法

5、：
　　第一部分
　　1、目標基因篩選和多重PCR引物設(shè)計
　　2、樣本準備
　　按照DNA提取試劑盒說明書操作，分別從骨髓細胞涂片和新鮮骨髓標本中提取核酸。
　　3、NGS測序。
　　4、Sanger測序。
　　第二部分
　　1、NGS測序方法與第一部分相同。
　　2、Sanger測序。
　　3、突變位點致病性預(yù)測。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1、Ion

6、 AmpliseqTM Desinger多重PCR引物設(shè)計方案
　　用Ion AmpliseqTM Desinger對目標基因設(shè)計多重PCR引物，設(shè)計方案結(jié)果:共652個擴增子，可以覆蓋98.03％的目標區(qū)域，PCR擴增在兩管內(nèi)完成，分別有332和320個擴增子，擴增子的長度在125bp和275之間。
　　2、NGS質(zhì)控
　　以一張芯片結(jié)果為例，測序結(jié)果顯示:芯片中磁珠覆蓋面積為80％，其中連接有文庫的為100％，除去

7、34％的多克隆，12％的低質(zhì)量文庫和1％測試片段，最終有效的文庫為57％，共2，884，511個讀取片段;產(chǎn)生的原始測序數(shù)據(jù)總量為409Mb;平均擴增子長度為139bp;測序每次添加核苷酸時，釋放的H+強度較一致;不同位置堿基的準確度都在98％以上;其中達到Q20(與參考序列99％匹配)的為352 Mb。單個樣品測序質(zhì)控顯示:測序覆蓋度較均一，可以與靶標區(qū)比對上的reads總數(shù)為493，804，占總靶標區(qū)的96.15％，每個堿基的平均覆

8、蓋度為517，堿基覆蓋的均一度為85.15％，可以被reads覆蓋的靶標區(qū)的堿基比例為94.51％，靶標區(qū)內(nèi)至少有20條reads比對上的堿基的比例為97.47％，沒有正/反鏈偏好性的堿基的比例為81.92％，大部分擴增子的GC含量都在50％附近，每個擴增子的覆蓋度比較均一，大部分分布在100-1000x之間，能從頭到尾測通的reads大部分超過了50％。說明NGS質(zhì)控合格。
　　3、樣本突變整體分布
　　經(jīng)過查詢dbSNP

9、、COSMIC等數(shù)據(jù)庫以及參照文獻報道，去除常見SNP位點后，67個目標基因中，有兩例以上出現(xiàn)重現(xiàn)性突變的基因共有18個，突變類型包括單堿基替換、插入和缺失。突變發(fā)生頻率最高的是NPM1、DNMT3A、FLT3和TET2（突變頻率分別為22.2％，22.2％，18.5％和18.5％）。如:NPM1的插入突變集中在12號外顯子上4個堿基的插入(c.859_860insTCTG，c.861_862insTGCA)，其中5例患者為A型突變，均

10、插入TCTG四個堿基，引起NPM1蛋白C端的框移突變;FLT3突變有兩種模式，插入突變和點突變，3例為發(fā)生在近膜結(jié)構(gòu)域14、15外顯子的內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(ITD)插入，2例為激酶結(jié)構(gòu)域20外顯子的第835個天門冬氨酸的點突變(TKD)，其中1例患者同時有ITD和TKD兩種突變。DNMT3A和TET2屬于表觀遺傳調(diào)節(jié)基因子，以點突變?yōu)橹?，DNMT3A檢出的6例突變中，5例為發(fā)生在23號外顯子上第882位點精氨酸的點突變，其中4例為R882H，

11、1例為R882C。測序結(jié)果不但可以顯示基因突變的類型，在染色體上的位置，還可以顯示突變堿基所占的比例，進而可以用于疾病進展過程中微小殘留的監(jiān)測。
　　4、Sanger測序結(jié)果
　　對所有標本的FLT3-ITD(exon14、15)、NPM1(exon12)和DNMT3A(R882位點附近)進行經(jīng)典的Sanger測序，共檢測到:FLT3-ITD陽性4例，NPM1陽性6例，DNMT3A陽性5例。與NGS結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，在擴增目的片

12、段一致的前提下，NPM1和DNMT3A的檢測兩種方法有很好的一致性，Sanger測序檢測到FLT3-ITD突變4例陽性樣品中，僅有1例用NGS未測出。
　　第二部分
　　1、NGS質(zhì)控
　　本部分研究檢測的芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控均合格，所有測序樣本的測序深度均在100-399X之間，90％以上的序列可以與靶標區(qū)目的序列比對上，靶標區(qū)堿基覆蓋度較均一。
　　2、NGS測序結(jié)果
　　對11例t(8;21) AML患者初診

13、和復(fù)發(fā)時的自身配對骨髓標本同時進行了NGS測序，結(jié)果顯示:所有檢出的突變以雜合型突變?yōu)橹?，而且在初發(fā)和復(fù)發(fā)時的突變細胞比例基本一致?；蛲蛔冾愋鸵詥螇A基替換為主。這些復(fù)發(fā)的患者在初診時每例檢測到1-4個基因突變，發(fā)生頻率最高的是C-KIT(6/11)，包括D816(exon17)突變3例（其中，D816Y、D816H、D816V各1例），N822(exon17)突變1例，M541(exon10)1例，R815_D816ins(exon1

14、7)1例;ASXL1、MLH1和TET2突變各2例;FBXW7、DNMT3A、NRAS和DNMT3B突變各1例。復(fù)發(fā)時，原有的6例C-KIT突變僅有4例仍然存在，2例丟失;新獲得了KIT P665突變1例，KIT P665、KIT N822突變1例。與初次診斷時相比，復(fù)發(fā)時有5例患者的基因突變模式未發(fā)生變化，6例發(fā)生了變化，其中新獲得的基因包括KMT2A、C-KIT、TET2和SH2B3，丟失的原有基因包括C-KIT和NRAS。分別有2

15、例患者在復(fù)發(fā)時獲得了KMT2A、C-KIT、TET2突變，1例獲得了SH2B3突變;2例患者復(fù)發(fā)時丟失了C-KIT，1例丟失了NRAS。
　　3、Sanger測序結(jié)果及其驗證
　　為了驗證NGS測序結(jié)果的可靠性，用Sanger方法測序檢測了所有標本的C-KIT外顯子8、17的突變情況。在初次診斷標本中檢測出17外顯子突變5例（D8163例，N8221例，R815_D816ins1例），復(fù)發(fā)標本檢測出17外顯子突變3例（D81

16、6、N822和R815_D816ins各1例），未檢測出8號外顯子突變，結(jié)果顯示兩種方法的一致性為100％。
　　4、重現(xiàn)性突變的MLH1致病性測序結(jié)果
　　測序結(jié)果顯示，有2例患者在初次診斷和復(fù)發(fā)時均出現(xiàn)MLH1c.1151T＞A突變，在本研究第一部分正常核型AML患者的基因突變譜中，也檢測出3例患者攜帶該突變，因此對該突變的原始結(jié)果進行了仔細分析，該位點的測序深度均在100X以上，均為雜合突變，位于其擴增子的中間部位。三

17、款軟件來預(yù)測該突變位點的致病性，polyphen-2預(yù)測的得分為0.998，為probably damaging;mutationtaster預(yù)測的結(jié)果為disease causing;MAPP-MMR預(yù)測的得分為5.120（得分大于4.55為具有致病性）。
　　結(jié)論：
　　1、本研究采用Ion Torrent PGMTM測序平臺，在原有商業(yè)化實體腫瘤基因突變試劑盒的基礎(chǔ)上成功加載了對AML預(yù)后具有預(yù)測價值的17個基因，經(jīng)過

18、27例染色體核型正常的AML患者樣本的檢測以及與經(jīng)典的測序方法比較，結(jié)果證明成功的建立了一套靈敏特異、可靠、高通量的AML突變檢測方法。
　　2、Ion Torrent PGMTM在長片段插入或缺失和單個堿基出現(xiàn)多次重復(fù)(即Homopolymer)區(qū)段的檢測中還有一定的缺陷。
　　3、在動態(tài)研究初次診斷和緩解后復(fù)發(fā)的伴有t(8;21)染色體核型異常的AML患者中，發(fā)現(xiàn)大部分患者出現(xiàn)了與初次診斷時不同的基因突變模式，其中C-K