應(yīng)用細胞芯片捕獲人腫瘤細胞并檢測其細胞表面CD抗原表型的表達.pdf

1、目的：
　　 腫瘤標(biāo)志物（tumormarker，TM），是指在腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細胞所產(chǎn)生或分泌并釋放到血液、體液中，反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)。腫瘤標(biāo)志物可以分成以下幾大類：①腫瘤胚胎性抗原；②酶和同工酶；③血漿蛋白；④細胞代謝產(chǎn)物；⑤腫瘤抗原；⑥癌基因和抑癌基因蛋白產(chǎn)物及微量元素。腫瘤抗原（tumorantigen）泛指在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中新出現(xiàn)或者過度表達的一些抗原物質(zhì)。
　　 免疫應(yīng)答過程有賴于免

2、疫系統(tǒng)中細胞間的相互作用，一種是通過細胞間的直接接觸，另一種是通過分泌細胞因子或其他活性分子而介導(dǎo)的相互作用。細胞表面功能分子是免疫細胞之間相互識別的物質(zhì)基礎(chǔ)，包括細胞表面的多種抗原、受體和其他分子。應(yīng)用單克隆抗體鑒定為主的方法，將來自不同實驗室的單克隆抗體所識別的同一分化抗原決定簇，統(tǒng)稱為CD（clusterofdifferentiation）。一些研究者研究發(fā)現(xiàn)，正常細胞和腫瘤細胞所表達的CD抗原不同，并且CD與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密

3、不可分的聯(lián)系。
　　 本課題研究制備的細胞芯片就是用來高通量檢測細胞表面CD抗原的表達情況。將六十四種CD抗原單克隆抗體固定于載體上，首先形成抗體點陣，隨后利用抗原、抗體特異性結(jié)合的原理，不同的單克隆抗體能夠自動識別和捕獲表達相應(yīng)表面分化抗原的細胞，從而檢測多種腫瘤細胞表面相應(yīng)CD表型的表達情況。細胞芯片技術(shù)可快速地分析正常與癌細胞表面CD抗原表型的差異，不僅有助于腫瘤發(fā)病機制的闡明，還能篩選腫瘤細胞CD抗原表型標(biāo)志物，在腫瘤的

4、發(fā)生機制研究、診斷和治療方面，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 方法：
　　 1、細胞培養(yǎng)
　　 培養(yǎng)9種細胞備用，人正常胃粘膜細胞系GES-1、人胃腺癌細胞系7901、人正常肝上皮細胞系L-02、人肝癌細胞系Bel7404、人胰腺癌細胞系PANC-1、人小細胞肺癌細胞系H446、人大細胞肺癌細胞系H460、人肺腺癌細胞系A(chǔ)549和人大腸癌細胞系HT29；
　　 2、應(yīng)用細胞芯片捕獲腫瘤細胞并檢測其細胞表面CD

5、抗原表型的表達；
　　 3、驗證細胞芯片檢測腫瘤細胞表面CD抗原表型表達的特異性；
　　 （1）應(yīng)用RT-PCR（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）方法驗證細胞芯片對人正常胃粘膜細胞系GES-1、人胃腺癌細胞系7901和人胰腺癌細胞系PANC-1細胞表面CD抗原表型的檢測結(jié)果；
　　 （2）基因測序驗證人正常胃粘膜細胞系GES-1、人胃腺癌細胞系7901細胞表

6、面CD抗原表型表達的RT-PCR擴增結(jié)果；
　　 （3）應(yīng)用流式細胞術(shù)驗證細胞芯片捕獲細胞的特異性；
　　 4、細胞芯片陽性點熒光標(biāo)記CD的篩選。
　　 結(jié)果：
　　 1、細胞芯片上CD13、CD29、CD49e、CD55、CD44、CD71、CD95、CD133抗體點捕獲到人小細胞肺癌細胞系H446細胞；CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD133、CD95抗體點捕獲

7、到人大細胞肺癌細胞系H460細胞；CD29、CD44、CD49e、CD55、CD61、CD71、CD133、CD90抗體點捕獲到人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞；CD9、CD15、CD24、CD29、CD44、CD55、CD66、CD71抗體點捕獲到人大腸癌細胞系HT29細胞；CD13、CD29、CD44、CD55、CD71抗體點捕獲到人胰腺癌細胞系PANC-1細胞；CD9、CD13、CD15、CD29、CD49e、CD44、CD55、CD7

8、1、CD77抗體點捕獲到人肝癌細胞系Bel7404細胞；CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD56、CD57、CD71抗體點捕獲到人正常肝上皮細胞系L-02細胞；CD9、CD13、CD15、CD24、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95抗體點捕獲到人正常胃粘膜細胞系GES-1細胞；CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95、CD77、CD133、CD1

9、03、CD64抗體點捕獲到人胃腺癌細胞系7901細胞。
　　 2、RT-PCR檢測人胃腺癌細胞系7901和人正常胃粘膜細胞系GES-1CD表型mRNA的表達，結(jié)果顯示7901和GES-1均有CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD7、CD95的表達，與我們的細胞芯片檢測CD表型的結(jié)果相一致；RT-PCR檢測人胰腺癌細胞系PANC-1CD表型mRNA的表達，結(jié)果顯示CD71、CD55均有表達，與我們的細胞芯

10、片檢測CD表型的結(jié)果相一致。
　　 3、應(yīng)用流式細胞術(shù)的方法，檢測人胃癌細胞系7901與人胃正常細胞系GES-1細胞表面CD15、CD24、CD44的表達，流式結(jié)果顯示與我們的細胞芯片檢測CD表型的結(jié)果相一致。
　　 4、從FITC-CD14、FITC-CD4、PE-CD3、FITC-CD19、PE-Cy5一CD19、FITC-Cy5-CD2、FITC-CD3、Cy-Chrome-CD22和PE-CD14等9種熒光標(biāo)記的

11、CD中，篩選最佳細胞芯片陽性標(biāo)點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PE-CD13效果最好。
　　 結(jié)論：
　　 1、細胞芯片CD29、CD44、CD49、CD55、CD71、CD133抗體點均捕獲人小細胞肺癌細胞系H446細胞、人大細胞肺癌細胞系H460細胞和人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞；CD13、CD95抗體點捕獲到人小細胞肺癌細胞系H446細胞和人大細胞肺癌細胞系H460細胞，未捕獲到人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞；CD9抗體點僅捕獲到人大細胞肺

12、癌細胞系H460細胞，未捕獲到人小細胞肺癌細胞系H446細胞和人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞；CD61、CD90抗體點僅捕獲到人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞，未捕獲到人小細胞肺癌細胞系H446細胞和人大細胞肺癌細胞系H460細胞。
　　 2、細胞芯片CD29、CD44、CD55、CD71抗體點均捕獲到消化系腫瘤細胞系細胞，人大腸癌細胞系HT29細胞、人胰腺癌細胞系PANC-1細胞、人胃腺癌細胞系7901細胞和人肝癌細胞系Bel7404細

13、胞；CD9抗體點捕獲到人大腸癌細胞系HT29細胞、人胃腺癌細胞系7901細胞和人肝癌細胞系Bel7404細胞，未捕獲到人胰腺癌細胞系PANC-1細胞；CD13抗體點捕獲到人胰腺癌細胞系PANC-1細胞、人胃腺癌細胞系7901細胞和人肝癌細胞系Bel7404細胞，未捕獲到人大腸癌細胞系HT29細胞；CD15抗體點捕獲到人大腸癌細胞系HT29細胞和人肝癌細胞系Bel7404細胞，未捕獲到人胰腺癌細胞系PANC-1細胞和人胃腺癌細胞系7901

14、細胞；CD49e、CD77抗體點捕獲到人胃腺癌細胞系7901細胞和人肝癌細胞系Bel7404細胞，未捕獲到人大腸癌細胞系HT29細胞和人胰腺癌細胞系PANC-1細胞；CD24、CD66、抗體點僅捕獲到人大腸癌細胞系HT29細胞；CD95、CD133、CD103、CD64抗體點僅捕獲到人胃腺癌細胞系7901細胞。
　　 3.、細胞芯片CD29、CD44、CD55、CD71抗體點均捕獲到人小細胞肺癌細胞系H446細胞、人大細胞肺癌細

15、胞系H460細胞、人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞、人大腸癌細胞系HT29細胞、人胰腺癌細胞系PANC-1細胞、人胃腺癌細胞系7901細胞和人肝癌細胞系Bel7404細胞。
　　 4、細胞芯片CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71抗體點捕獲到人肝癌細胞系Bel7404細胞和人正常肝上皮細胞系L-02細胞；CD15、CD77抗體點僅捕獲到人肝癌細胞系Bel7404細胞，未捕獲到人肝上皮細胞系L-02細胞；C

16、D56、CD57抗體點僅捕獲到人正常肝上皮細胞系L-02細胞，未捕獲到人肝癌細胞系Bel7404細胞。
　　 5、細胞芯片CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD71、CD95抗體點均捕獲到人正常胃粘膜細胞系GES-1細胞和人胃腺癌細胞系7901細胞；CD15、CD24抗體點僅捕獲到人正常胃粘膜細胞系GES-1細胞，未捕獲到人胃腺癌細胞系7901細胞；CD77、CD133、CD103、CD64抗體點僅捕獲

17、到人胃腺癌細胞系7901細胞，未捕獲到人正常胃粘膜細胞系GES-1細胞；CD15和CD24可能是人正常胃粘膜細胞系GES-1細胞的表面標(biāo)志物，CD77、CD133、CD103、CD64可能是人胃癌細胞系7901細胞的標(biāo)志物。
　　 6、RT-PCR檢測人胃腺癌細胞系7901和人正常胃粘膜細胞系GES-1CD表型mRNA的表達，結(jié)果顯示7901和GES-1均有CD9、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD55、CD7、CD

18、95mRNA的表達，與我們的細胞芯片檢測CD表型的結(jié)果相一致；RT-PCR檢測人胰腺癌細胞系PANC-1CD表型mRNA的表達，結(jié)果顯示CD71、CD55均有表達，與我們的細胞芯片檢測CD表型的結(jié)果相一致。
　　 7、應(yīng)用流式細胞術(shù)的方法，檢測人胃腺癌細胞系7901與人胃正常細胞系GES-1細胞表面表達CD15、CD24、CD44，結(jié)果顯示，人胃腺癌細胞系7901細胞表面不表達CD15、CD24，表達CD44；人胃正常細胞系GE