DSG2F536C Knock-In小鼠模型的病理表型及其致病機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分 DSG2F536C Knock-In小鼠的建立及病理表型研究
　　背景:致心律失常性右室心肌?。╝rrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC）的病理特征為心肌進(jìn)行性地被纖維和/或纖維脂肪組織替代，臨床好發(fā)各種室性心律失常，是引起心源性猝死的重要原因之一。近年來，分子遺傳學(xué)研究揭示約50％以上的ARVC患者攜帶有橋粒基因突變。我們前期對(duì)中國漢族DS家系A(chǔ)RVC患者

2、進(jìn)行基因篩查，發(fā)現(xiàn)編碼橋粒芯糖蛋白(Desmoglein-2，DSG2)基因發(fā)生變異c.1592T＞G，導(dǎo)致第531位的半胱氨酸被苯丙氨酸替代(DSG2F531C)，但該突變是否具有致病性還缺少最直接的證據(jù)。
　　目的:建立DSG2F536C Knock-In小鼠模型，觀察該小鼠模型心臟病理表型特征。
　　方法:采用同源重組靶基因敲入技術(shù)構(gòu)建DSG2F536C Knock-In小鼠模型，對(duì)小鼠尾DNA的PCR擴(kuò)增鑒定小鼠的基

3、因型;Masson染色、H&E染色和油紅O染色觀察DSG2F536C Knock-In小鼠心肌病理學(xué)改變;透射電鏡(TEM，Transmission electron microscopy)觀察小鼠心臟超微結(jié)構(gòu);免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）和Western blot檢測分別觀察小鼠心臟DSG2蛋白的亞細(xì)胞定位和表達(dá)。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了3種基因型的DSG2F536C Knock-In小鼠，分為純合

4、型組（DSG2m/m）、雜型組（DSG2m/+）和野生型組（DSG2+/+）。結(jié)果如下:(1)常規(guī)病理檢查:2周齡時(shí)，DSG2+/+小鼠、DSG2m/+小鼠和DSG2m/m小鼠均未見明顯異常。10周齡時(shí)，DSG2m/m小鼠的右心室出現(xiàn)心肌排列紊亂、纖維化和炎性反應(yīng)，約1/3的小鼠同時(shí)累及左心室，同時(shí)纖維化區(qū)域可見脂肪浸潤，而DSG2m/+小鼠僅見心肌排列紊亂。(2)膠原容積分?jǐn)?shù)(Collagen volume fraction，CVF)

5、:與DSG2+/+和DSG2m/+小鼠相比，DSG2m/m小鼠右心室的CVF明顯增加（DSG2+/+vs.DSG2m/m，3.46％±1.94％ vs.24.72％±2.23％，P＜0.001;DSG2m/+ vs.DSG2m/m，3.14％±1.46％ vs.24.72％±2.23％，P＜0.001），而DSG2m/+小鼠的右心室的CVF與DSG2+/+小鼠之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。而左心室的CVF，在三組之間均無顯著統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)差異（P＞0.05）。(3) TEM: DSG2+/+和DSG2m/+可觀察到典型的橋粒結(jié)構(gòu)，而DSG2m/m小鼠未觀察到類似結(jié)構(gòu)，且可觀察到心臟閏盤區(qū)明顯增寬、線粒體減少。(4) IHC和Western blot: IHC的結(jié)果顯示DSG2m/m小鼠心臟閏盤區(qū)未見DSG2蛋白的表達(dá)，而DSG2+/+小鼠和DSG2m/+小鼠均在閏盤區(qū)正常表達(dá)。Western blot檢測各組小鼠心臟總的DSG2蛋白的表達(dá)，結(jié)果提示與DSG2+/+小鼠

7、（0.482±0.188）和DSG2m/+小鼠（0.388±0.090）相比，DSG2m/m小鼠的DSG2蛋白（0.004±0.003）幾乎不表達(dá)，而DSG2+/+小鼠和DSG2m/+小鼠的DSG2蛋白表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:10周齡DSG2m/m小鼠出現(xiàn)類似于臨床ARVC患者的疾病特征，包括以右心室為主的炎性反應(yīng)、心室纖維化和脂滴浸潤等大體病理改變，橋粒結(jié)構(gòu)異常、閏盤區(qū)增寬和線粒體減少等超微表型，以及DSG2

8、蛋白表達(dá)異常等，提示DSG2F536C突變?yōu)锳RVC的致病性突變，為進(jìn)一步深入研究DSG2F536C突變導(dǎo)致ARVC的發(fā)病機(jī)制提供了良好的動(dòng)物模型。
　　第二部分 DSG2F536C突變導(dǎo)致ARVC機(jī)制的初步研究
　　背景:現(xiàn)已知，致心律失常性右室心肌?。╝rrhythmogenic right ventricularcardiomyopathy，ARVC）的發(fā)病機(jī)制涉及多種信號(hào)通路的調(diào)控，包括Wnt信號(hào)通路的抑制、Hipp

9、o信號(hào)通路的激活、iASPP信號(hào)通路的下調(diào)和TGF-β1信號(hào)通路的激活等。我們成功構(gòu)建了DSG2F536C Knock-In小鼠，研究顯示該模型小鼠具有炎性反應(yīng)、鈣化、心室纖維化和脂滴浸潤等類似于人類ARVC的表型，提示該突變?yōu)橹虏⌒酝蛔?。然而，DSG2F536C致ARVC的分子機(jī)制目前尚未明確。目的:探討DSG2F536C突變致ARVC的發(fā)病機(jī)制是否涉及Wnt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、iASPP信號(hào)通路和TGF-β1信號(hào)通路。

10、r>　　方法:以DSG2F536C Knock-In小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，分為純合型小鼠組（DSG2m/m）、雜型小鼠組（DSG2m/+）和野生型小鼠組（DSG2+/+）。觀察各信號(hào)通路的主要蛋白的表達(dá):(1) Wnt信號(hào)通路:應(yīng)用IHC測定盤狀球蛋白(plakoglobin，PG)的亞細(xì)胞定位情況，Western blot測定PG的表達(dá);(2)Hippo信號(hào)通路:Western blot檢測Yes相關(guān)蛋白(Yes associated

11、protein，YAP)及其磷酸化產(chǎn)物(P-YAP);(3) iASPP信號(hào)通路:Western blot檢測p53凋亡刺激蛋白抑制物（inhibitor of apoptosis-stimulating protein of p53，iASPP）的表達(dá);(4) TGF-β1信號(hào)通路:Western blot檢測轉(zhuǎn)化生長因子β1（transfominggrowth factorβ1，TGF-β1）的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1) Wnt

12、信號(hào)通路:IHC的結(jié)果顯示DSG2+/+、DSG2m/+和DSG2m/m小鼠的PG正常定位于心臟閏盤區(qū)，且Western blot結(jié)果及其半定量分析提示PG蛋白的表達(dá)量在三組小鼠之間未見明顯差異(P＞0.05);(2) Hippo信號(hào)通路:Western bolt結(jié)果顯示P-YAP、YAP的表達(dá)以及P-YAP/YA的比值在三組小鼠之間未見顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);(3) iASPP信號(hào)通路:Western bolt結(jié)果提示iASP

13、P蛋白表達(dá)在三組小鼠之間未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);(4)TGF-β1信號(hào)通路:Western bolt結(jié)果顯示，與DSG2+/+小鼠相比，DSG2m/+和DSG2m/m小鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達(dá)顯著升高（DSG2+/+ vs.DSG2m/+，0.202±0.010 vs.1.048±0.444，P＜0.05; DSG2+/+ vs.DSG2m/m,0.202±0.010 vs.0.814±0.347，P＜0.05），而D