小鼠Mageb18基因克隆、表達分析及其調節(jié)黑色素瘤B16-F0細胞惡性表型的初步研究.pdf

1、黑色素瘤相關抗原(melanoma-associated antigens，MAGE)是一個多成員基因家族。目前在人、大鼠和小鼠中已經發(fā)現(xiàn)的MAGE基因約100個左右。所有的MAGE基因其蛋白序列中都有一個含200個氨基酸左右的結構域，稱為MAGE同源結構域(MHD)。根據(jù)MAGE基因序列保守性的不同，這些基因可以分為多個不同的亞家族。另外，根據(jù)表達譜的不同，MAGE基因還可以分為Ⅰ型和Ⅱ型兩類。Ⅰ型MAGE基因由MAGE-A、-B和-

2、C三個亞家族組成，其他的亞家族則都屬于Ⅱ型MAGE基因。已經發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型MAGE基因在許多不同類型的腫瘤組織和細胞中表達，但是在正常組織中只有睪丸、卵巢和胎盤表達。正好相反，Ⅱ型MAGE基因卻在許多正常組織中廣譜表達。因為睪丸、卵巢和胎盤中HLA分子的表達水平很低，因此Ⅰ型MAGE基因獨特的表達特點使得它們成為腫瘤免疫治療的理想靶標。目前，針對Ⅰ型MAGE基因已經開發(fā)了許多不同類型的腫瘤疫苗，有的甚至已經開始進入臨床試驗。但是，由于對Ⅰ型

3、MAGE基因的表達譜及功能的研究相對較少，因此這在很大程度上限制了MAGE腫瘤疫苗的推廣和應用。
　　 雖然有研究表明，Ⅰ型MAGE基因在正常組織中的表達是睪丸特異的，但是我們前期利用表達序列標簽(expressed sequence tag，EST)序列都對應于小鼠Mageb18基因。據(jù)此，我們假設認為，小鼠Mageb18基因在正常組織中的表達不是睪丸特異的，而是廣譜的。本課題的目的就是克隆小鼠的Magebl8基因，分析它的表

4、達特征以及調控機制，并研究它在調節(jié)腫瘤細胞惡性表型方面的功能以及相關分子機制。
　　 為此，我們首先借助生物信息學工具分析和預測了Mageb18基因的結構和功能。結果表明，小鼠Mageb18基因全長2160bp，由5個外顯子組成。它最大的開放閱讀框為984bp，編碼蛋白含327個氨基酸，蛋白的理論分子量和等電點分別為37203.31 Da和6.43。MAGEB18蛋白含有一個MAGE N-末端結構域和一個保守的MHD，分別位于A

5、rg3-Asp82和he91-Ala289。亞細胞定位預測表明，MAGEB18蛋白不含亞細胞定位序列，但是可能存在8個磷酸化位點和一個N-豆蔻?；稽c，提示MAGEB18可能是一個胞漿蛋白，并且存在翻譯后修飾加工。以前的研究表明，Ⅰ型MAGE基因主要定位在X染色體，而且同一亞族的基因往往形成相對獨立的基因簇。染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，小鼠Mageb18基因也定位在X染色體的C2-C3區(qū)域，并與其他多個MAGE-B亞家族的基因形成基因簇。而且系

6、統(tǒng)進化樹分析也表明，Mageb18基因與MAGE-B亞家族基因間的親緣關系最近。此外，基因同源搜索則發(fā)現(xiàn)，Mageb18基因在高等哺乳動物中高度保守，而在哺乳動物以外的物種中不存在。這些結果集中提示，Mageb18基因是一個在高級哺乳動物中高度保守的Ⅰ型MAGE基因。
　　 接下來，RT-PC分析Mageb18基因的表達譜發(fā)現(xiàn)，小鼠Mageb18基因在正常組織中的表達確實是非睪丸特異的。除了睪丸以外，它在胃、大腸、小腸、脾臟、淋

7、巴結、骨髓和外周淋巴細胞都有較高水平表達。另外，我們發(fā)現(xiàn)Mageb18基因在小鼠睪丸中的表達是發(fā)育相關的。它在出生后第1天的睪丸中開始表達，而且隨著時間的進行它的表達逐漸增高，在第21天左右達到最高，此后一直維持在較高的表達水平，提示Mageb18可能與睪丸的發(fā)育和精子的形成有關。繼續(xù)分析Mageb18基因在小鼠細胞株中的表達譜發(fā)現(xiàn)，Mageb18在成纖維瘤細胞L929、黑色素瘤細胞B16-F0、肝癌細胞MM45T.Li、乳腺癌細胞4T

8、1、胚胎成纖維細胞NIH3T3和巨噬細胞RAW264.7中表達，而在肝癌細胞H22和腦膠質瘤細胞C6中不表達。但是DNA甲基轉移酶抑制劑5-氮-2’-脫氧胞苷和組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古霉素A能夠激活Mageb18陰性細胞H22和C6中Mageb18基因的表達，提示表觀遺傳機制調節(jié)Mageb18的轉錄激活。
　　 然后，利用Western印跡分析HEK293中瞬時表達的HA-MAGEB18融合蛋白表明，小鼠Mageb18基因編碼

9、的蛋白大小約為46 kDa。進一步分析小鼠正常組織中內源性MAGEB18蛋白則發(fā)現(xiàn)，MAGEB18蛋白在小鼠的胃、大腸、小腸、脾臟、淋巴結、骨髓和血液淋巴細胞中表達，而在腦、心臟、肺、肝臟和腎臟中不表達，提示在正常組織中MAGEB18蛋白的表達譜與其mRNA的表達譜完全一致。另外，在組織中全長MAGEB18蛋白大小也為46 kDa左右，但是它可能存在翻譯后的剪切加工，從而產生一條大小約為26 kDa的片段。奇怪的是，小鼠細胞株中的內源性

10、MAGEB18蛋白只存在大小為46 kDa一種形式。這些結果提示，MAGEB18蛋白在小鼠組織和細胞株中可能存在不同的翻譯后修飾，從而導致形成大小不同的蛋白產物。利用間接免疫熒光分析.MAGEB18蛋白的亞細胞定位表明，小鼠MAGEB18蛋白主要定位在細胞漿中，但在不同細胞株的細胞核里也有或多或少的定位。免疫組化分析進一步發(fā)現(xiàn)，在睪丸組織中MAGEB18蛋白主要在具有增殖能力的初級和次級精原細胞的細胞漿中表達，但是在成熟的精子中不表達。

11、這些結果提示，MAGEB18蛋白是一個胞漿蛋白，它可能與細胞的增殖表型有關。
　　 接下來，為了闡明Mageb18基因的功能，我們通過siRNA技術干擾內源性MAGEB18基因的表達，定量RT-PCR和Western印跡分析表明siRNA能夠有效抑制細胞中Mageb18基因在mRNA和蛋白水平的表達。隨后我們通過生長曲線分析、平板克隆形成實驗以及皮下成瘤實驗證明，干擾Mageb18基因的表達能夠顯著抑制B16-F0細胞和4T1細

12、胞體外和體內的增殖。Annexin-V-APC/7-AAD細胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，干擾Mageb18能夠顯著增強B16-F0細胞的凋亡。Western印跡分析則表明，這個細胞凋亡增強的過程可能與TP53通路有關，因為干擾MAGEB18蛋白的表達能夠提高TP53的蛋白水平，同時激活TP53的靶基因p21和Bax。
　　 最后，進一步分析Mageb18基因在小鼠細胞株中的表達發(fā)現(xiàn)，MAGEB18蛋白在高成瘤和高轉移的腫瘤細胞株，包括腫瘤干

13、細胞和前癌干細胞中表達，提示Mage18基因不僅與細胞增殖表型有關，而且可能還調節(jié)細胞的轉移特性。為此，我們通過劃痕實驗、基質膠侵襲實驗以及體內肺轉移動物模型分析了Mageb18基因對B16-F0細胞運動性的影響。結果表明，干擾MAGEB18蛋白的表達能夠顯著抑制B16-F0細胞的遷移、侵襲和轉移能力。基質金屬蛋白酶家族在腫瘤的遷移和轉移中扮演重要角色。我們通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，B16-F0細胞表達多種不同類型的MMPs。但是，干擾

14、Mageb18基因以后只能特異性地下調MMP2和MMP9的表達，而其他MMP的表達卻沒有明顯的差異。這些結果提示，Mageb18基因確實可以通過MMP2和MMP9調節(jié)B16-F0細胞的遷移、侵襲和轉移。
　　 總之，我們的工作首次證明小鼠Mageb18基因一個非睪丸特異表達的Ⅰ型MAGE基因。我們的結果提示，某些Ⅰ型MAGE基因，至少是Mageb18基因的表達并不像傳統(tǒng)觀點所認為的那樣是睪丸特異的，而是廣譜的。由于MAGE家族基