HS影響B(tài)16F10黑色素瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、目的：主要從HS對于腫瘤生長，腫瘤血管生成，腫瘤細(xì)胞基底膜侵襲作用，腫瘤血行和外滲過程用四個方面的影響，通過一系列體內(nèi)外實驗來探討HS對于B16F10黑色素瘤轉(zhuǎn)移的影響，并進(jìn)一步探討HS發(fā)揮作用的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1)建立B16F10黑色素瘤(C57BL/6小鼠)自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型，將小鼠隨機(jī)分成4組，接種8天后給藥，分別腹腔注射給予生理鹽水、HS5.2mg/kg/day，HS11.6mg/kg/day，HS26m

2、g/kg/day，連續(xù)38天。第23天切除荷瘤足部，觀察HS對原發(fā)瘤增殖的影響；接種腫瘤第46天處死動物取肺，稱重并計算肺表面的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)進(jìn)而評價其抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用效果；采用MTS比色法研究HS對于B16F10細(xì)胞以及HUVEC增殖的影響，以評價HS體外抑制腫瘤轉(zhuǎn)移活性以及為后面的體外實驗劑量確定提供依據(jù)。
　　 2)采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖、遷移及小管形成模型研究HS體外抗血管生成作用；以雞胚絨毛尿囊膜實驗?zāi)Ｐ秃突?/p>

3、質(zhì)膠栓(Matrigel Plug)實驗?zāi)Ｐ蛠硌芯縃S對體內(nèi)血管生成的影響；全面評價HS對血管生成的影響。
　　 3)建立B16F10黑色素瘤(C57BL/6小鼠)實驗性肺轉(zhuǎn)移模型，將小鼠隨機(jī)分為4組，分別腹腔注射給予生理鹽水、HS5.2mg/kg/day，HS11.6mg/kg/day，HS26mg/kg/day，連續(xù)23天，第23天處死動物取肺，稱重，統(tǒng)計后評價HS對B16F10細(xì)胞血行過程以及穿出血管過程的影響；體外采用改

4、良的Boyden小室法研究HS對B16F10細(xì)胞基底膜侵襲能力的影響。
　　 4)采用免疫蛋白印記法分析HS對B16F10細(xì)胞分泌的MMP-2，MMP-9，VEGF等幾個細(xì)胞因子表達(dá)，免疫組化法測定自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移原發(fā)腫瘤組織內(nèi)CD34、VEGF、MMP-2、MMP-9等因子的表達(dá)，從而進(jìn)一步探討HS對腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1)B16F10黑色素瘤自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型結(jié)果表明，對的影響，與對照組相比，H

5、S各劑量組的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少(P<0.05)，且與劑量呈相關(guān)性。與對照組相比，HS26mg/kg劑量組的肺重明顯低于對照組的肺重(P<0.01)，其他兩組無明顯作用，HS對于接種B16F10黑色素瘤細(xì)胞后的小鼠足墊部的原發(fā)位腫瘤無論是體積以及重量都沒有明顯的影響，各給藥組小鼠體重增加幅度與對照組相當(dāng)；MTS結(jié)果顯示，HS在劑量1μM-100μM之間均能抑制B16F10細(xì)胞增殖，其他劑量結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義，而HS在劑量高達(dá)50μM時才會

6、對HUVEC的正常生長有明顯的抑制作用(P<0.01)，其他各劑量組無論從形態(tài)上還是實際測得的吸光度對HUVEC細(xì)胞的正常生長均無顯著的影響。
　　 2)與陽性VEGF對照組相比，HS在劑量為2μM(P<0.05)、10μM(P<0.05)和50μM(P<0.01)時均會抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖，其他的劑量組無顯著性的影響；HUVEC遷移實驗表明，HS2μM、10μM、50μM、作用與VEGF誘導(dǎo)的HUVEC后，細(xì)胞的遷

7、移運動明顯被抑制，遷移過膜的細(xì)胞明顯減少，與VEGF組相比有明顯差異(P<0.05)；與VEGF對照組相比，HS(0.4μM，P<0.01；2μM，P<0.01；10μM，P<0.01；HS50μM，P<0.01)劑量依賴性抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC小管形成，0.08μM對VEGF誘導(dǎo)的小管形成沒有影響；大鼠主動脈環(huán)血管生成實驗結(jié)果顯示，從實驗第7天管腔結(jié)構(gòu)計數(shù)數(shù)據(jù)得出，HS高劑量50μM能夠明顯抑制管腔結(jié)構(gòu)的形成(P<0.01)，其

8、余各給藥組無顯著意義，這可能是由于50μM HS對內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞毒性作用所致，但從動脈環(huán)照片可以看到HS對于血管芽生作用有一定抑制作用但是作用不顯著；HS劑量依賴性抑制雞胚尿囊膜上新生血管數(shù)，HS中劑量組(50μg/雞蛋)和HS高劑量組(100μg/雞蛋)給藥載體周圍血管支點數(shù)明顯少于生理鹽水組，HS低劑量組(25μg/雞蛋)無影響；Matrgel Plug實驗可以看到HS中劑量(5.2mg/kg/day)和高劑量組(26mg/kg/da

9、y)的Plug顏色明顯比對照組蒼白，Matrigel Plug中血紅蛋白含量的測定結(jié)果顯示給藥組(5.2mg/kg/day和26mg/kg/day)血紅蛋白含量明顯低于對照組(P<0.01)。
　　 3)B16F10細(xì)胞Matrigel侵襲實驗表明HS0.5μM顯著抑制B16F10細(xì)胞侵襲作用(P<0.01)，抑制率達(dá)33％，HS0.004μM，0.02μM，0.1μM也能明顯抑制B16F10細(xì)胞的侵襲能力(P<0.05)，呈量

10、效關(guān)系；B16F10黑色素瘤實驗性轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示，與模型組相比，HS高劑量組(26mg/kg)和中劑量組(11.6mg/kg)均能顯著減輕小鼠肺組織重量。各給藥組小鼠死亡率與對照組比較無明顯差別，小鼠體重未發(fā)生明顯減少現(xiàn)象。
　　 4)B16F10黑色素瘤細(xì)胞MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)隨著HS劑量增加有減少的趨勢，HS0.5μM最為明顯，MMP-2，MMP-9和VEGF表達(dá)顯著減少；HS抑制B16F10自發(fā)性腫瘤