β-欖香烯抑制小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞及眼內(nèi)種植瘤生長(zhǎng)的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　眼內(nèi)黑色素瘤是成人眼內(nèi)主要的原發(fā)性惡性腫瘤，對(duì)患者的視力及生命均構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前缺乏控制生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的有效方法。β-欖香烯是從中藥香茅草中提取的有效抗癌成分，具有抗腫瘤譜廣，毒副作用輕微的突出優(yōu)點(diǎn);目前臨床廣泛用于惡性胸膜腔積液、肺癌、消化道腫瘤以及其他淺表性腫瘤;但其作用機(jī)制尚不明確。故本實(shí)驗(yàn)旨在現(xiàn)有腫瘤研究的基礎(chǔ)上探討β-欖香烯能否抑制小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，能否抑制小鼠眼內(nèi)種植瘤的生長(zhǎng)，以及潛在的作用

2、機(jī)制，以尋找一種新的能夠有效控制這一眼內(nèi)惡性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的治療方法。實(shí)驗(yàn)選用小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞系作為研究對(duì)象，分三部分進(jìn)行:
　　1、體外實(shí)驗(yàn):探討β-欖香烯對(duì)小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用及對(duì)urokinase-type plasminogen activator(uPA)、uPA receptor(uPAR)、 Matrixmetalloproteinase-2(MMP-2)、MMP-9表達(dá)的影響

3、。
　　2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):應(yīng)用小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞建立小鼠眼內(nèi)種植黑色素瘤模型，探討β-欖香烯對(duì)小鼠眼內(nèi)種植瘤生長(zhǎng)的抑制作用及對(duì)uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響。
　　3、分子機(jī)制:在前兩部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用特異性ERK1/2通路抑制劑U0126，深入探討β-欖香烯對(duì)小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用、對(duì)uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)的影響以及對(duì)通路ERK1/2磷酸

4、化表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1、體外實(shí)驗(yàn)部分:首先通過(guò)MTS法檢測(cè)β-欖香烯對(duì)小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用、初步摸索出用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的β-欖香烯作用濃度，依據(jù)上述結(jié)果應(yīng)用Transwell法、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-欖香烯對(duì)小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，應(yīng)用Real-timePCR、WesternBlot的方法檢測(cè)β-欖香烯對(duì)uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。
　

5、　2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分:實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，在手術(shù)顯微鏡下直視操作，應(yīng)用小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞建立小鼠眼內(nèi)黑色素種植瘤模型。建模后3天觀(guān)察小鼠眼內(nèi)情況，分別給予眼周注射β-欖香烯和眼周注射空白乳劑，實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后摘取小鼠眼球，通過(guò)對(duì)腫瘤大小測(cè)量、Real-time PCR、免疫組化法、Western Blot法檢測(cè)β-欖香烯對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響及對(duì)uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。

6、>　　3、分子機(jī)制:在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用特異性ERK1/2通路抑制劑U0126后，通過(guò)Transwell法檢測(cè)β-欖香烯對(duì)小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用、Real-time PCR檢測(cè)β-欖香烯對(duì)uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響、Western Blot法檢測(cè)β-欖香烯對(duì)uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)以及對(duì)通路ERK1/2磷酸化表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1、

7、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:MTS結(jié)果顯示，在24h、48h、72h時(shí)，隨著β-欖香烯作用時(shí)間的延長(zhǎng)、濃度的增加，對(duì)小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞存活率的抑制增強(qiáng)，抑制濃度始于100μM; Transwell法和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示β-欖香烯能夠抑制小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移;Real-time PCR結(jié)果顯示β-欖香烯在mRNA水平抑制uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9的表達(dá);免疫組化法和Western Blot法顯示β-欖香烯在蛋白水平抑

8、制uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9的表達(dá)。
　　2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:β-欖香烯作用后的腫瘤大小明顯減小;Real-time PCR結(jié)果顯示β-欖香烯在mRNA水平抑制uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9的表達(dá);免疫組化法和Western Blot法顯示β-欖香烯在蛋白水平抑制uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9的表達(dá)。
　　3、分子機(jī)制研究顯示:β-欖香烯、U0126均能抑制小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)

9、移、下調(diào)uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9表達(dá);兩者聯(lián)合作用后，增強(qiáng)了作用效果;隨著β-欖香烯作用時(shí)間的延長(zhǎng)、藥物濃度的增加對(duì)磷酸化ERK1/2表達(dá)的抑制作用增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　1、通過(guò)MTT、Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)、免疫組化、PCR、Western Blot檢測(cè)手法證實(shí)β-欖香烯通過(guò)下調(diào)uPA、uPAR、MMP-2、MMP-9表達(dá)而發(fā)揮抑制B16F10黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。
　　2、通過(guò)對(duì)腫瘤