基于基因免疫的綠色熒光蛋白單克隆抗體制備與鑒定.pdf

1、近十年來綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)在分子生物學、細胞生物學以及醫(yī)藥學等方面得到了廣泛的應用.針對原核表達GFP作為免疫原制備單抗有一定困難的實際情況,該研究采用基因免疫的方法制備單抗.實驗中以表達GFP的真核質粒pVAX1-EGFP為免疫原,建立了有效的免疫程序,并成功研制出GFP的特異性單克隆抗體.真核質粒pVAX<,1>-EGFP免疫程序大致步驟為:大提純化質粒pVAX1-EGFP,經(jīng)

2、瓊脂糖電泳和真核細胞(P815)轉染試驗鑒定后,經(jīng)腿部雙側股四頭肌注射免疫6周齡雌性BALB/c小鼠,每只小鼠質粒免疫劑量為100μg,三周后同法進行第二次免疫,六周后第三次免疫,第九周加強免疫,加強免疫后一周采血測血清ELISA抗體效價,同時取免疫小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞Sp2/0-Ag-14進行融合.以間接ELISA試驗進行篩選,篩選出陽性克隆,并經(jīng)有限稀釋法三次亞克隆之后,共獲得四株穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為

3、1A12,3C8,3D6,4D9.對單抗的特異性鑒定結果表明,雜交瘤培養(yǎng)上清的間接ELISA效價分別為1:3200、1:1600、1:3200、1:2560,腹水效價為1:50000、1:13000、1:40000、1:25000.四株單抗的免疫球蛋白亞類均為IgG<,1>.在Dot-ELISA試驗中四株單抗均與原核表達GFP的菌株反應,而對其它菌株不反應.經(jīng)過Western-blot分析,四株單抗均與27KD條帶處的GFP反應,而不與