用綠色熒光蛋白和肝再生增強因子基因進行轉(zhuǎn)基因綿羊胚胎的研究.pdf

1、內(nèi)蒙古大學博士學位論文用綠色熒光蛋白和肝再生增強因子基因進行轉(zhuǎn)基因綿羊胚胎的研究姓名：馬玉珍申請學位級別：博士專業(yè)：動物學指導教師：扈廷茂20040501蘭至堡里堡壘莖壟墨里塑墅墨蘭壟墨里至差璺壟堡莖墨里堡苧墅墮塑! 墨共作用時間8 h r ，轉(zhuǎn)染效率為每視野4 2 個熒光細胞，F(xiàn) e g e n e 一6 轉(zhuǎn)染s F F C s 較為適宜的條件， F e g e n e 一6 6 u l ，D N A2 u g ，共作用時間1 2 h

2、 r 。轉(zhuǎn)染效率為每視野1 9 個熒光細胞。轉(zhuǎn)染結(jié)果表明：對于綿羊胎兒成纖維細胞，L i p o f e c t A M I N E “轉(zhuǎn)染效率較好，為目的基因轉(zhuǎn)染s F F C s 提供了參考依據(jù)。3 ．綠色熒光蛋白對綿羊胎兒成纖維細胞生物學特性的影響及綿羊胎兒成纖維細胞性別鑒定L i p o f e c t A M I N E “介導p E G F P —C 1 轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的6 只綿羊胎兒s F F C s ，經(jīng)G 4 1 8篩選

3、1 2 天，挑選發(fā)綠色熒光的單克隆細胞擴大培養(yǎng)2 3 天( 轉(zhuǎn)基因后共培養(yǎng)3 5天) ，進行細胞形態(tài)觀察、生長曲線以及染色體核型分析。結(jié)果表明，整合有E G F P基因的s F F C s 與對照組細胞比較，在細胞形態(tài)、生長曲線、染色體正確核型率上無明顯差別。同時利用P C R 方法對體外培養(yǎng)的6 只綿羊胎兒的s F F C s 進行性別決定區(qū)( S e xd e t e r m i n i n gr e g i o no ft h e

4、Y ，S R Y ) 基因檢測，以明確s F F E s性別。結(jié)果顯示：6 只綿羊胎兒成纖維細胞中，其中2 只為雌性胎兒細胞、4 只為雄性胎兒細胞，對S R Y 基因的分析與染色體分析結(jié)果一致，明確了s F F C s 的性別，可通過體細胞核移植進j 亍己知性別的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊的研究。4 ．綠色熒光蛋白和肝再生增強因子融合基因在綿羊胎兒成纖維細胞中的表達利用L i p o f e c t A M I N E “介導線性化p E G F

5、P ／A L R 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染s F F C s 。經(jīng)G 4 1 8 篩選，l O d 后共形成3 8 個單克隆細胞，其中2 3 個克隆發(fā)熒光，1 j 個克隆不發(fā)熒光。挑選3 個熒光細胞克隆和3 個不發(fā)熒光的細胞克隆擴大培養(yǎng)，用P C R 、聚丙烯酰胺凝膠電泳及免疫組化檢測。結(jié)果表明：3 個熒光單克隆細胞均有A L R 、N e o 。基因的P C R 產(chǎn)物，聚丙烯酰胺凝膠電泳可見5 7 K D 大小的融合蛋白，免疫組化檢測到A L R 蛋