綠色熒光蛋白轉基因小鼠的建立及可視化胚胎工程的研究.pdf

1、綠色熒光蛋白(GFP)是海洋生物水母(aequorea，victoria)體內分離純化出來的一種能發(fā)射強烈熒光的特殊蛋白質，在無任何協(xié)同因子、底物或附加基因產物存在的情況下就能產生穩(wěn)定的熒光，而且這種熒光很容易通過熒光顯微鏡或者肉眼即可觀察到。因此，GFP是一種全新的、應用廣泛的遺傳標記(genetic marker)和蛋白質標記物(protein tag)。 綠色熒光蛋白可以提高轉基因動物的制備效率，即將待轉的目的基因構件與

2、GFP基因串聯(lián)起來一并整合，由于GFP基因的表達產物在胚胎發(fā)育的早期即可檢測到，我們可以只選擇那些只表達了GFP陽性重組體的胚胎進行移植，這樣即減少移植胚胎的盲目性，又提高轉基因動物的制作效率。 用顯微注射法將GFP基因注入FVB/NJ小鼠受精卵原核內，獲得的子代鼠3周后，提取鼠尾基因組DNA，應用PCR技術進行檢測，獲得5只PCR陽性小鼠；通過整體成像儀觀察其中3只(F0)有綠色熒光表達。對F0代轉基因小鼠進行傳代，獲得子代

3、小鼠通過整體成像儀觀察7只(F1)有綠色熒光表達，繼而在F1代GFP轉基因小鼠中進行交配，得到子代鼠，經(jīng)整體成像儀觀察，發(fā)現(xiàn)35只(F2)小鼠有綠色熒光表達，表明初步建立了全身有熒光表達并能傳代的GFP轉基因小鼠。這為我們進行可視化胚胎工程研究奠定了基礎。 GFP轉基因小鼠可視化胚胎工程的實驗研究： (1)采集GFP轉基因雄鼠附睪尾部精子與常規(guī)超排法得到KM鼠的卵母細胞在培養(yǎng)液中進行體外受精，建立體外受精模型，并將受

4、精卵移入培養(yǎng)液中進行體外培養(yǎng)。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，體外受精后6h受精卵有綠色熒光表達. (2)將體外受精后的胚胎體外培養(yǎng)至囊胚，觀察該胚胎卵裂球發(fā)育分化的情況。有的胚胎發(fā)生阻滯而未能繼續(xù)發(fā)育；有的發(fā)育至4-8細胞期；有的胚胎可發(fā)育至桑椹胚和囊胚階段，整個胚胎呈現(xiàn)綠色熒光。雖然胚胎質量的優(yōu)劣是影響體外培養(yǎng)是否成功的重要因素，而對其起決定作用的是胚胎體外培養(yǎng)條件，其中包括培養(yǎng)液的成分和培養(yǎng)體系。 (3)GFP轉基因小