綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及可視化胚胎工程的研究.pdf

1、綠色熒光蛋白(GFP)是海洋生物水母(aequorea，victoria)體內(nèi)分離純化出來的一種能發(fā)射強(qiáng)烈熒光的特殊蛋白質(zhì)，在無任何協(xié)同因子、底物或附加基因產(chǎn)物存在的情況下就能產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光，而且這種熒光很容易通過熒光顯微鏡或者肉眼即可觀察到。因此，GFP是一種全新的、應(yīng)用廣泛的遺傳標(biāo)記(genetic marker)和蛋白質(zhì)標(biāo)記物(protein tag)。 綠色熒光蛋白可以提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備效率，即將待轉(zhuǎn)的目的基因構(gòu)件與

2、GFP基因串聯(lián)起來一并整合，由于GFP基因的表達(dá)產(chǎn)物在胚胎發(fā)育的早期即可檢測(cè)到，我們可以只選擇那些只表達(dá)了GFP陽性重組體的胚胎進(jìn)行移植，這樣即減少移植胚胎的盲目性，又提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作效率。 用顯微注射法將GFP基因注入FVB/NJ小鼠受精卵原核內(nèi)，獲得的子代鼠3周后，提取鼠尾基因組DNA，應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，獲得5只PCR陽性小鼠；通過整體成像儀觀察其中3只(F0)有綠色熒光表達(dá)。對(duì)F0代轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行傳代，獲得子代

3、小鼠通過整體成像儀觀察7只(F1)有綠色熒光表達(dá)，繼而在F1代GFP轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行交配，得到子代鼠，經(jīng)整體成像儀觀察，發(fā)現(xiàn)35只(F2)小鼠有綠色熒光表達(dá)，表明初步建立了全身有熒光表達(dá)并能傳代的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠。這為我們進(jìn)行可視化胚胎工程研究奠定了基礎(chǔ)。 GFP轉(zhuǎn)基因小鼠可視化胚胎工程的實(shí)驗(yàn)研究： (1)采集GFP轉(zhuǎn)基因雄鼠附睪尾部精子與常規(guī)超排法得到KM鼠的卵母細(xì)胞在培養(yǎng)液中進(jìn)行體外受精，建立體外受精模型，并將受

4、精卵移入培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，體外受精后6h受精卵有綠色熒光表達(dá). (2)將體外受精后的胚胎體外培養(yǎng)至囊胚，觀察該胚胎卵裂球發(fā)育分化的情況。有的胚胎發(fā)生阻滯而未能繼續(xù)發(fā)育；有的發(fā)育至4-8細(xì)胞期；有的胚胎可發(fā)育至桑椹胚和囊胚階段，整個(gè)胚胎呈現(xiàn)綠色熒光。雖然胚胎質(zhì)量的優(yōu)劣是影響體外培養(yǎng)是否成功的重要因素，而對(duì)其起決定作用的是胚胎體外培養(yǎng)條件，其中包括培養(yǎng)液的成分和培養(yǎng)體系。 (3)GFP轉(zhuǎn)基因小