可視化胰蛋白酶原Ⅱ外分泌功能轉(zhuǎn)基因小鼠的制備研究.pdf

1、胰腺外分泌功能研究是為了從生理的角度觀察胰腺的正常分泌的過程或從病理生理的角度來探討胰腺疾病的發(fā)病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)利用顯微注射技術(shù)試圖建立一種胰腺外分泌功能的轉(zhuǎn)基因動物模型，利用整體成像儀能夠在活體內(nèi)動態(tài)地觀察到胰蛋白酶原Ⅱ的分泌過程。為研究胰腺外分泌功能生理機(jī)制和與胰腺外分泌功能相關(guān)的疾病(如胰腺炎、胰腺癌)的發(fā)生、發(fā)展過程的病理生理機(jī)制以及篩選治療上述疾病的藥物提供理想的動物模型。為此，本文進(jìn)行了如下的研究： 1.目的基因的構(gòu)建

2、：1.1胰蛋白酶原Ⅱ信號肽(Pre-pro)基因的構(gòu)建：采用人工合成Pre-pro基因：5’aattcatgagtgcacttctgatcctagctcttgttggagctgctgttgctttccccgtggatgatgatgacaaga3’gtactcacgtgaagactaggatcgagaacaacctcgacgacaacgattggggcacctacgactactgttcttcgttggag3’agcaacctcctag5’

3、其5’端帶有EcoRⅠ，3’端帶有BamHⅠ酶切位點(diǎn)。 1.2中間載體pPreEGFP的構(gòu)建：我們將Pre-pro基因定位克隆到pEGFP-N1載體的EcoRⅠ，BamHⅠ位點(diǎn)，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(EGFP)的5’端與Pre-pro基因相連接，這一載體我們稱之為：pPreEGFP 1.3載體pPEL-PreEGFP的構(gòu)建：將在胰腺中特異性表達(dá)的彈性酶Ⅰ啟動子(RatElastaseⅠPromoter，PEL)克隆到p

4、PreEGFP載體的HindⅢ及EcoRⅠ位點(diǎn)，PEL的3’端與Pre-pro基因的5’端相連，這一載體我們稱之為pPEL-PreEGFP。 1.4目的基因PEL-Pre-EGFP的獲得：BindⅢ和SphⅠ雙酶切pPEL-PreEGFP質(zhì)粒，位點(diǎn)從622至2926，經(jīng)過純化，獲得2305bp的目的基因片斷。 2.轉(zhuǎn)PEL-Pre-EGFP基因小鼠的建立：通過顯微注射的方法將目的基因PEL-Pre-EGFP注入小鼠的受精

5、卵，將注射過的受精卵移植到假孕母鼠體內(nèi)，產(chǎn)下F0代轉(zhuǎn)基因鼠。 3.PEL-Pre-EGFP轉(zhuǎn)基因鼠的檢測3.1PCR檢測F0代轉(zhuǎn)PEL-Pre-EGFP基因鼠，用以初步篩選整合有PEL-Pre-EGFP基因的陽性F0代鼠。 3.2Sothernblot雜交分析：對PCR陽性鼠進(jìn)一步作Southern分析以確認(rèn)基因組中是否整合PEL-Pre-EGFP。 3.3利用整體成像儀在F0代轉(zhuǎn)基因小鼠活體內(nèi)觀察在胰腺內(nèi)是否有

6、綠色熒光的表達(dá)。 在本實(shí)驗(yàn)中，已成功構(gòu)建了目的PEL-Pre-EGFP基因片段，經(jīng)過測序證實(shí)構(gòu)建正確無誤。通過顯微注射法共注射受精卵1288枚，成活受精卵共520枚，注射后的成活率約為40％；成活的受精卵移植到假孕母鼠后，共產(chǎn)下F0代轉(zhuǎn)基因鼠24只，出生率為4.6％。在24只F0代轉(zhuǎn)基因小鼠中，有7只具有PCR陽性。對PCR陽性鼠進(jìn)行Southern雜交檢測，有1只為陽性，陽性率約為4％。但本實(shí)驗(yàn)到論文定稿時尚未在整體成像儀中觀

7、察到胰腺中表達(dá)有綠色熒光蛋白。 作者通過本實(shí)驗(yàn)已系統(tǒng)掌握了制備轉(zhuǎn)基因動物的全部流程，首先構(gòu)建了質(zhì)粒并進(jìn)行鑒定，其次應(yīng)用顯微注射法獨(dú)立完成轉(zhuǎn)基因動物的研制及檢測，所做的工作主要包括注射針、持卵針、洗卵針、移卵針的制作、雄鼠的結(jié)扎、小鼠(供體雌鼠)的超數(shù)排卵、假孕母鼠的制作、受精卵的采集、培養(yǎng)、顯微注射、注射后受精卵的移植等一系列操作。本實(shí)驗(yàn)在課題的設(shè)計上為胰腺外分泌功能動物模型制作方面提供了一個可行的思路，初步探討了用轉(zhuǎn)基因的方法