化學誘導去核法在延邊黃牛體細胞核移植中的應用研究.pdf

1、試驗目的：以延邊黃牛為研究對象，尋求一種操作簡單、相對無損傷、去核效率高的去核方法，從而為體細胞核移植效率的提高打下基礎，為產業(yè)化生產提供理論依據。
　　試驗方法：通過對兩種不同的去核化學試劑的去核率和發(fā)育率的比較確立了脫羰秋水仙堿的可靠性和可行性。
　　試驗結果：
　　1.在脫羰秋水仙堿的不同濃度（0μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml）去核率的比較實驗中，0.3μg/m

2、l和0.6μg/ml兩種濃度去核率分別是61.29％和55.60%差異不顯著，0.4μg/ml和0.5μg/ml兩種濃度去核率分別是81.80%和83.33%差異不顯著，但0.3μg/ml和0.6μg/ml與0.4μg/ml和0.5μg/ml兩組之間去核率卻差異顯著（P﹤0.05），從而確定了0.4μg/ml和0.5μg/ml兩種濃度是此化學去核試劑去核率的最佳濃度，并通過對供試卵母細胞Hoechst33342染色、熒光顯微鏡的觀察，試

3、驗結果顯示較適合延邊黃牛體細胞克隆的化學去核率最佳濃度為0.4μg/ml。
　　2.為了確定脫羰秋水仙堿的最佳的激活后時間和最佳去核作用時間，在0.4μg/ml濃度下分別進行了p.a0min作用時間30min、60min、90min、120min和p.a30min作用時間為30min、60min、90min、120min和p.a60min作用時間為30min、60min、90min、120min和p.a90min作用時間為30mi

4、n、60min、90min、120min和p.a120min作用時間為30min、60min、90min、120min通過Hoechst33342染色、熒光顯微鏡的觀察，試驗結果顯示延邊黃牛卵母細胞的最佳的激活后時間為90min,最佳去核作用時間為90min。
　　3.在延邊黃牛卵母細胞卵齡對去核率的影響試驗中，在脫羰秋水仙堿濃度0.4μg/ml最佳的激活后時間90min和最佳去核作用時間90min下，分別對18～20h,20～2

5、2h,22～24h卵母細胞卵齡做了去核率比較，其中18～20h和20～22h去核率差異不顯著，與22～24h的去核率差異顯著，所以試驗選擇20～22h的卵母細胞卵齡作為最佳試驗卵齡。
　　4.在確定鬼臼亞乙苷的濃度試驗中，分別對0μg/ml、25μg/ml、36μg/ml、50μg/ml、63μg/ml、75μg/ml濃度進行了去核率的試驗，其中0μg/ml、25μg/ml差異不顯著，25μg/ml、36μg/ml差異不顯著，36

6、μg/ml、75μg/ml差異不顯著63μg/ml、75μg/ml差異不顯著，50μg/ml去核率最高與其它各個濃度均差異顯著，所以50μg/ml濃度是延邊黃牛卵母細胞去核率的最佳濃度。
　　5.在鬼臼亞乙苷的作用時間試驗中，對供試卵母細胞分別作用了0min時去核率為4.00%，60min時去核率為38%，90min時去核率為32.86%，120min時去核率為60.45%，150min時去核率為56.67%，180min時去核率

7、為40%,其中60min、90min、180min之間差異不顯著，120min、150min之間差異不顯著且去核率最高，從而確立了鬼臼亞乙苷的最佳作用時間為120min。
　　6.在第六個實驗中比較了兩種化學去核試劑以及顯微操作去核方法對重構胚發(fā)育率的影響，孤雌激活對照組囊胚發(fā)育率為37.98%，脫羰秋水仙堿的囊胚發(fā)育率為27.08%，鬼臼亞乙苷沒能發(fā)育到囊胚，顯微操作去核法囊胚發(fā)育率為17.87%，其中脫羰秋水仙堿和顯微操作去核