化學輔助去核法在延邊黃牛體細胞核移植中應用的研究.pdf

1、【目的】為避免盲吸法去核造成的大量胞質流失，DNA染色和紫外線照射對卵母細胞造成的傷害，本研究使用化學誘導劑脫羰秋水仙堿(Demecolcine，簡稱Deme)對延邊黃牛卵母細胞進行化學輔助去核，旨在為延邊黃牛核移植建立一套操作簡便，對卵母細胞損傷少，高效穩(wěn)定的去核方法，為進一步提高延邊黃牛核移植效率打下良好的基礎。
　　【方法】將體外成熟至中期和末期延邊黃牛卵母細胞分別使用濃度為0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/m

2、L的Deme在分別為30min、45min、60min的不同時長下處理，顯微操作去除牛卵母細胞核,并將去核的卵母細胞作為受體，構建重構胚并觀察發(fā)育情況；在不同時期添加6－二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)，觀察其對末期卵母細胞核移植的影響；比較不同成熟時期的受體細胞質對延邊黃牛卵母細胞體細胞克隆卵裂率以及囊胚發(fā)育率的影響。
　　【結果】1）體外成熟22h的卵母細胞在0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL的Deme溶液中處

3、理45min，顯核率與去核率無顯著差異，去核率達100％，但是0.2μg/mL處理組的囊胚發(fā)育率顯著高于其他處理組；45min處理組的顯核率顯著高于30min、60min處理組，45min處理組的囊胚發(fā)育率率高于其他處理組；化學輔助去核法的囊胚發(fā)育率顯著高于盲吸法。
　　2）體外成熟28h后激活的卵母細胞在0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL的Deme溶液中處理45min，顯核率與去核率無顯著差異，去核率達100%

4、，但是0.3μg/mL處理組的囊胚發(fā)育率顯著高于其他處理組；45min處理組的顯核率顯著高于30min、60min處理組，45min處理組的囊胚發(fā)育率高于其他處理組；化學輔助末期去核法的囊胚發(fā)育率顯著高于盲吸法。
　　3）體外成熟的老化卵母細胞，使用離子霉素單獨處理后91%被激活,而在離子霉素聯(lián)合添加6-DMAP處理后卻沒有細胞被激活，也就是沒有第二極體的排出.另外,融合后使用6-DMAP處理，所得重構胚的囊胚發(fā)育率最低，而激活后

5、的卵母細胞立即用6-DMAP處理，所得重構胚的發(fā)育能力與無6-DMAP處理的相近。
　　4）MII期卵母細胞的顯核率與TII期卵母細胞的顯核率無顯著差異；但是TII期卵母細胞所得重構胚的卵裂率及囊胚發(fā)育率均顯著高于 MII期卵母細胞所得重構胚的卵裂率及囊胚發(fā)育率。
　　【結論】將Deme的使用濃度降低至0.2μg/mL、作用時間控制在45min，中期卵母細胞能夠達到很好的去核效果。而在末期延邊黃牛卵細胞的中，脫羰秋水仙堿的最